前言 细胞培养的基本概念 细胞培养的基本条件 细胞培养的基本方法 细胞培养的污染和检测 细胞冻存和复苏 细胞管理及保藏 细胞毒性检测 Wilhelm Roux (1850-1924 ) 1885年Roux最早尝试使组 织离体培养，材料是鸡胚神经 板，采用生理盐水为培养液， 并首次采用组织培养这个术语 。 1.前言 Alexis Carrel France Rockefeller Institute for Medical Research New York, NY, USA b. 1873 d. 1944 1907年Harrison 和1912年 Carrel开始把组织培养作为一种 方法，用于研究离体动物细胞 的培养。 他建立的鸡胚胎成纤维细胞 持续了34年之久(1912-1946) 器官培养 (Organ culture)：将活体中整个 器官或一部分器官取出， 置于体外生存、生长并同 时保持其一定的结构和功 能特征。 组织培养 (Tissue culture)：把活体的一小 片组织（O.51立方毫米 ）置于底物上孵育，细胞 自其周围移出并生长。 细胞培养(cell culture) ：把提取的组织用机械或 消化的方法分散成单个细 胞悬液，后进行培养，增 殖。 肿瘤 胚胎 成体 粗切 消化细切修切 细胞培养 组织培养器官培养 活细胞 便于观察检测 条件可控 均一性 便于人工筛选 失去原有组织结构和形态，趋向单一性 分化减弱 可能获得不死性 贴壁型：动物的正常细胞 悬浮型：血液淋巴细胞、肿瘤细胞、植物细胞 固定化培养 来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，内皮细胞 形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出23个长短不等的突起 中有卵圆形核 生长特点： 排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞细胞接触易断开而单独行动 原代细胞：从机体取出后立即培养 的细胞 原代培养：将从体内取出的细胞进 行培养 传代培养：从原代培养细胞继续转 接培养 传代细胞：在体外培养条件下持续 传代培养的细胞 无菌 无毒、生物相容性 清洁的环境 品质良好的细胞来源，培养基配制使用高纯度药品和 去离子水 有标准化的工作方法 培养用的液体极多，应由专人负责，配制浓度准确， 所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否 和制备日期等 一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章， 其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分 开，已消毒品与未消毒品应分别存放 无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高 效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工 作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌 器，抗生素 细胞生长条件：培养板，培养瓶，CO2培养箱， 培养基，血清 细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板 震荡器，高速离心机，移液器 细胞保存条件：液氮罐，超低温冰箱 超净工作台 高压蒸汽灭菌器 过滤除菌装置 倒置显微镜 水纯化装置 恒温培养箱 电热干燥箱 离心机、天平、水浴、摇床 液氮罐 冰箱：4、-20 、-80 移液器 移液管 吸管 培养瓶： 25cm2、75cm2、150cm2 培养皿： 30、60、120毫米 多孔培养板： 4、6、24、96孔 离心管 冻存管 基础培养基 8095 血清 520 青、链霉素 各100Uml 天然培养基： 血清 血浆 组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液） 合成培养基： 根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法 模拟合成的。 包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合 物 目前常用培养基：RPMI-1640、DMEM、M199、MEM 、 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和 繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。 常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清 、 马血清等 优质血清的标准 透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体 、 病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性） 56 ，30 分钟。 血清的消毒：过滤除菌 其他细胞培养用液 n水：新鲜的三蒸水或去离子水 n平衡盐溶液 主要由无机盐和葡萄糖配制而成 作用：维持渗透压、缓冲和调节酸碱度 常用的缓冲液： 生理盐水 PBS Hanks液 （D-Hanks常用于配制胰酶溶液） n通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗 溶液”。 n配制 具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万U/瓶，用注 射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万U/瓶，加5ml灭 菌双蒸水，即每毫升各为20万U。 n使用时溶入培养液中，使青、链霉素的浓度最 终为100U/ml。 n庆大霉素：使用终浓度为100U/ml，广谱、稳定 。 主要作用： 水解与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋 白及糖蛋白，使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞分离。 常用浓度：0.25% 用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液或D-Hanks配制，用滤 器过滤除菌。 消化时间： 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。 物 品湿 热热干 热热过过 滤滤紫 外 化学 气体 消毒剂剂 电电离 辐辐射 培养室 工作台 玻璃 制品 金属 器械 塑料 制品 橡胶 制品 培养 用液 布类类 棉类类 贴附生长型细胞 必须贴附于底 物才能生长的细 胞。从形态上大 体分为上皮细胞 型及成纤维细胞 型，还有一些难 以确定其稳定形 态的细胞。 4.4.细胞培养的基本方法细胞培养的基本方法 粘着、粘附 （attachment） 铺展 （spreading) 1）取材 切割 组织块培养法 消化培养法 2）直接购买 培养 （原代培养） 传代传代 体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以 便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。 培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起 营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率 转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。 弃去旧培养液 清洗 加入消化液 吸弃消化液 加入培养液 吹打分散细胞 分装稀释细胞 补加培养液 继续培养 接种数量为51048105个/ml。 传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长 前有较长的滞留期。 培养液由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大 密度需要换液或进行传代培养。 如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行 传代。 游离期 悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。 吸附期 贴附底物，一般24小时内贴壁。 潜伏期 此时细胞有生长活动，基本无增殖。 细胞株潜伏期一般为624小时。 对数生长期 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合 进行实验研究。 停止期（平台期） 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。 机制：接触抑制、密度依赖性 肉眼观察：培养液的颜色和透明度 显微镜观察 生长良好的细胞：细胞透明度大，折光性强， 轮廓不清 生长状态不良的细胞：细胞轮廓增强，细胞折 光性变弱；胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒 状物质；细胞之间空隙增大；细胞形态不规则 ，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落； 有时细胞表面及周围出现丝絮状物 每毫升细胞数 血细胞计数板 细胞生长曲线 贴壁率 有丝分裂指数(MI)：分裂相数量占全部细胞数量 的百分比 细胞群体倍增时间 四唑盐(MTT)比色法 标记胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入量 细胞活力：总细胞中活细胞所占的百分比 台盼蓝法 四唑盐(MTT)比色法 荧光素双乙酸酯法(FDA) 四唑盐（MTT）比色法 MTT比色法的原理： 活细胞中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶 干水的蓝紫色产物甲臢（formazan)，并沉淀在 细胞中，而死细胞没有这种功能。 二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶 物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。 甲臢染料在A570nm处产生吸收值，用酶标仪测定A值 。 细胞大小：显微测微计法 细胞重量：称重法 鲜重 干重 细胞固定 苏木精-伊红染色 Giemsa染色 Feulgen染色 考马斯蓝染色 免疫法 细胞核染色：Hoechst、DAPI 混浊、pH异常改变、细胞外形 模糊、漂浮的集落 细胞出现增殖缓慢或死亡 化学物质的污染 非同种细胞污染 微生物污染：细菌、真菌、支 原体、病毒 5.5.细胞培养的污染和检测细胞培养的污染和检测 培养液变黄，出现浑浊 镜下可见圆球状颗粒漂浮 预防和处理：青霉素、链霉素 培养液一般不浑浊 白色或黄色小点漂浮于培养基表面 光镜观察到菌丝 预防和处理：抗真菌剂 可透过滤膜 无细胞壁 细胞营养液仍清亮但变黄，细胞生长变缓，部分细胞发生 脱落，细胞间隙可见铺满细沙样小点。 预防 重新培养 鉴别 清除：抗生素、加温、支原体特异性血清、共培养 法、重新克隆法、动物体内接种除菌法 防止交叉污染 慢冻快融 低温保护剂：10%的甘 油或二甲亚砜DMSO 细胞深低温保存的基本原理： -80以下时，细胞内的酶活性均己停止，即 代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱 水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生 大的冰晶；相反，冰晶很大，大冰晶会造成细胞膜、细胞 器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形 成大冰晶，即冰晶的重结晶。 对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称；细胞的 命名无严格统一规定，大多采用有一定意义缩写字母或代号 表示。但不论什么形式，均不宜太长，以便记忆和了解。 HeLa：为供体患者的姓名(Henrietta Lacks，来源于宫颈癌) CHO：中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary) NIH/3T3：美国国立卫生研究所(National Institute of Health)建立, 每3天传代一次，每次接种3106细胞毫升 。 主细胞库 生产用细胞库 原始细胞库 主细胞库 生产细胞库 ATCC (American Type Culture Collection) www.atcc.org ECACC (European Collection of Cell Cultures) www.hpacultures.org.uk 中国科学院典型培养物保藏 委员会细胞库 8.8.细胞毒性细胞毒性检测检测 参照GB/T16886.5-2003（或ISO10993-5 ） ，医疗器械生物学评价-第5部分：细胞毒性试验 体外法规定的方法进行检测。 l样品准备 辐照灭菌 l将待检材料在相应条件下浸提（不含血清的培养基中在37环境下浸 提24h） l细胞计数 l接种于96孔培养板，置CO2培养箱37培养24h后，弃去原培养液。空 白对照组加入新鲜细 胞培养液，供试品加入样品浸提液（加血清）， 置CO2培养箱继续 培养（至少24h） l于设定培养时间 后置显微镜下观察细胞形态，每孔加入20L质量浓 度为5g/L的MTT溶液，继续 培养4h后弃去孔内液体，加入200L DMSO， 在酶标仪 570 nm波长下测定吸光度，计算相对增值率（RGR）。 细胞毒性评价:根据下式计算相对增殖率(Relative growth rate, RGR) 。 RGR =实验组OD均值/阴性对照组OD均值100% 级别级别相对对增值值率/% 0 100 180-99 250-79 330-49 40-29 将样