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第十章 蛋白质的研究方法与原理 第一节 概 述 蛋白质的分离纯化包括以下过程: 1.破碎生物组织,并用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来; 2.将有关的蛋白质分级沉淀下来; (盐析法或有机溶剂法) 3.应用层析法或电泳法使它们各自分开; 4.蛋白质结晶; 5.蛋白质纯度鉴定和含量测定。 直接从生物组织中提纯蛋白 制备过程中注意事项: 要求自始至终保持在天然状态 1. 避免一切过激因素-如过酸或过碱,高温, 重金属等的影响。 2. 通常都在低温条件下操作。 3. 尽可能使样品中蛋白质的浓度维持在较高 水平。 第二节 蛋白质的分离与纯化技术 一、蛋白质沉淀与结晶 (一)盐析法 概念:将中性盐加入蛋白质溶液,破坏水化膜和 电荷而使蛋白质沉淀,叫盐析。各种蛋白质盐析 所需的盐浓度及PH不同,加入不同浓度的中性盐 可使各种蛋白质依次分别沉淀出来。 优点:操作简便 对易变性的蛋白质有一定的保护作用, 适用范围十分广泛。 缺点:分辨能力差,纯化倍数低 (1)盐的种类 对同一种Pr而言,价数愈高的盐离子,盐析能力 也愈强: PO3-4SO42-C2O42-(CHOHCOO-)2 ACCLNO3-Br -I-CNS- K+Rb+Na+Cs+Li+NH4+ 常用的中性盐有如硫酸盐、磷酸盐等。 硫酸铵(常用盐析剂) 优点:盐析能力较强 具有较高的溶解度 较低的溶解度温度系数 价格低廉 不产生副作用。 缺点:缓冲能力较差 PH难控制 (2)PH和温度 S。代表蛋白质在无机盐溶液中的溶解度 除取决于Pr的种类,还受PH及温度影响: PH=PI时,S。的数值极小 S。随温度增加而减低。 盐析过程中,若增高温度,有助于Pr的析出。 (3)蛋白质浓度 Pr较高,在较低无机盐浓度时,蛋白质便开 始析出,盐析界限比较宽。 Pr较低,需要无机盐的浓度也高,即盐析 界限变窄。 1.基本原理 (1)在PI附近,Pr主要以中性离子形式存在。此时若添加 有机溶剂,由于有机溶剂可使溶液电离常数减小,增强了 中性离子间静电引力,从而使分集合而沉淀出来。 (2)有机溶剂本身的水合作用会破坏Pr表面的水合层,也 促使Pr变得不稳定而聚集析出. 常用的有机溶剂:乙醇和丙酮 (二)有机溶剂沉淀法 分辨力比盐析方法高,提纯效果好 (三)选择性沉淀法 选择一定的条件使其它蛋白质变性沉淀而不影响目标 蛋白质的分离方法。例如,将提取液加热至一定温度 并维持一段时间,是某些不耐热的蛋白质变性沉淀等 。应用选择星辰殿,徐实现对系统中需除去的及欲提 纯的蛋白质的理化性质均有较全面的了解。 (四)蛋白质结晶 蛋白质结晶即是溶液中的蛋白质由随机状态转变为有 规则排列状态的固体,常用语分析研究其结构。 蛋白质结晶是一个有序化过程,当蛋白质溶液达到过 饱和状态,能够形成一定大小的晶核,溶液中的分子 失去自由运动的能量,不断地结合到形成的晶核上, 长成适合于X线衍射分析的晶体。 二、离心技术分离蛋白质 离心技术是利用物体 告诉旋转时产生强大的离 心力,使置于旋转体中的 悬浮颗粒发生沉降或漂浮 ,从而使某些颗粒达到浓 缩或与其它颗粒分离之目 的。 三、层析技术分离纯化蛋白质 最基本的特征: 固定相 流动相 层析技术(chromatography)又称色谱技术,是利 用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。 各种物质得以分离的最基本原因:就在于它们在这 两个相之间具有不同的分配系数.两相作相对运动时, 这些物质在两相间进行多次的分配,即使它们的分 配系数只有微小的差异,通过这个过程也能得到最 大的分离效果。 气相层析 按两相状态来分 液相层析 吸附层析 分配层析 离子交换层析 按层析机理来分 凝胶排阻层析 亲和层析 柱层析 按操作方式来分 薄层层析 纸层析 层析技术的种类 (一)凝胶过滤层析 又称分子筛或凝胶过滤(gel filtration) 原理:载体为有一定孔径的多孔性亲水性凝胶。当分 子大小不同的混合物通过这种凝胶柱时,直径大于孔 径的分子将不能进入凝胶内部,便直接沿胶粒间隙流 出(全排出)。较小的分子进入能容纳它的孔穴,绕 道而行,在柱内保留时间就比较长。这样,较大的分 子被先洗脱下来,而较小的分子后被洗脱下来,从而 达到相互分离的目的。 离子交换层析法 *原理:阴(阳)离子交换树脂颗粒(作为固定相) 填充在层析柱内,由于阴(阳)离子交换树 脂颗粒上带正(负)电荷,能吸引溶液中的 阴(阳)离子。然后再用含阴(阳)离子的 溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱 下来,增加阴离子浓度,含负电量多的蛋白 质也被洗脱下来,于是两种蛋白质被分开。 亲和层析法 原理:利用生物高分子具有能和某些相对应的专一 分子可逆结合的特性。 如,酶的活性部位能和底物抑制剂辅助因子专 一性地结合,改变条件又能使这种结合解除. 酶的变构中心与变构因子(或称效应物)之 间、抗体与抗原之间、激素与受体之间,结 合蛋白与结合物之间。 这些被作用的对象物质称之为配基(ligand) 。 高效液相层析法(High Performance Liquid Chromatography ,HPLC) 又称“高压液相色谱,是色谱法的一个重要分支,以 液体为流动相,采用高压输液系统,将具有不同极性 的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相 泵入装有固定相的色谱柱,在柱内各成分被分离后, 进入检测器进行检测,从而实现对试样的分析。 四、电泳技术分离蛋白质 电泳(electrophoresis)是指带电粒子在电场 中向着与其所带电荷相反方向电极移动的现象。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS (十二烷基硫酸钠)是阴离子型去污剂 (Sodium dodecyl sulfate, SDS) Q u = (迁移率)6r u 与 Q、 r有关 若蛋白质分子带有足够的电荷,在SDS-PAGE中进 行电泳,由于分子筛效应, u 仅取决于分子的大小。 因此 SDS一凝胶电泳可以按蛋白质分子大小的不同将其 分开。 这时,若以分子量的对数(logM)对相对于染料前沿 的迁移率(Rf)作图,呈现线性关系。 这种关系,对一种胶浓度时,只适用于一定的 分子量范围: 5胶浓度时,适用于分子量6200万的区间; 10胶浓度时,适用于分子量1.67万的区间; 15胶浓度时,适用于分子量1.24.5万的区间。 聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱 等电聚焦电泳(isoelectric focusing, IEF) 是一种根据样品的等电点不同而使它们在pH梯度中相互 分离的一种电泳技术。 利用特殊的一种缓冲液(两性电解质)在凝胶(常用聚 丙烯酰胺凝胶)内制造一个pH梯度。 pH梯度制作利用的两性电解质(ampholyte,商品名为 ampholine),是脂肪族多胺和多羧类的同系物,他们具有 相近但不同的pKa和pI值。在外电场作用下,自然形成pH梯 度。 凝胶可用:聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等 Pr分子有一定的PI,它处在一个由阳极到阴极梯 度逐渐增加的介质中,并通过以直流电时,它便“ 聚焦”在与其PI相同的pH位置上。PI不同的蛋白质 泳动后形成位置不同的区带而得到分离。 优点: 1.有很高的分辨率; 2.可以区分等电点只有 0.01 pH单位差异的蛋白质; 3.根据其所在位置还能够测定蛋白质的分子量; 4.对很稀的样品,最后达到高度的浓缩。 双向电泳(two-dimensional gel electrophoresis) 第一向采用聚丙烯酸胺凝胶等电聚焦电泳-PI 第二向采用SDS一凝胶电泳-分子量 由于结合了蛋白质的等电点和分子量两种完全不 同的特一性来进行分离,因此具有非常高的分辨率 可同时分析几千上万个蛋白,分辨率高,分离度好。 是蛋白质组学研究的核心技术。 双向PAGE 具有以下特征的蛋白质在二维电泳中还很难被 检测到: 等电点(pl)值很大或很小的,比如大于8和小于4 的那些蛋白质; 分子质量很大的蛋白质,比如大于l00kDa的蛋白 质就比实际的少了,而大于150kDa的蛋白质就几 乎完全探测不到了(尽管在一维电泳凝胶上这些 大蛋白质都能清楚地被观察到; 疏水性蛋白质。 双向电泳技术缺点 高效毛细管电泳 1.毛细管区带电泳(CZE) 毛细管区带电泳也称为自由溶液溶液区带电 泳, 这种电泳模式的特征是整个系统都用同一种 缓冲溶液充满,带电粒子的迁移速度依赖物质的 荷/质比差异。荷/质比越大,泳动越快。 2.毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis ,CGE) 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。 其具有多孔性,类似分子筛的作用,试样分子按大小分 离。能够有效减小组分扩散,所得峰型尖锐,分离效率高。 特点:抗对流性好,散热性好,分离度极高。 3. 胶束电动毛细管色谱(Micellar electrokinetic capillary chromatography,MEKC) 缓冲溶液中加入离子型表面活性剂,其浓度达到临界 浓度,形成一疏水内核、外部带负电的胶束。中性分子在 胶束相和溶液(水相)间分配,疏水性强的组分与胶束结 合的较牢,流出时间长;可用来分离中性物质,扩展了高 效毛细管电泳的应用范围。 在电场力的作用下 ,胶束在柱中移动。 4.毛细管等电聚焦电泳(Capillary isoelectric focusing,CIEF) 是根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术; CIEF是在毛细管内充有两性电解质,当施加直流电压(6 8V)时,管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度; 具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移,分别 到达满足其等电点pH的位置时,呈电中性,停止移动,形成 窄溶质带而相互分离;此法可用于测定蛋白质的等电点、纯 度鉴定、不同变异体的分析等。 5.毛细管等速电泳(Capillary isotachophoresis , CITP) 将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛 细管)和尾随离子,试样离子的淌度全部位于两者之间,并 以同一速度移动。 负离子分析时,前导电解质的淌度大于试样中所有负离子 的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进,逐渐形 成各自独立的区带而分离。阴极进样,阳极检测。 6.亲和毛细管电泳(affinity capillary electrophoresis, ACE) 是毛细管内壁涂布或在凝胶中加入亲和配基,以亲 和力的不同达到分离目的。 7.毛细管电动色谱(Capillary electrokinetic chromatography ,CEC) 在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液, 以“电渗泵”取代机械泵,试样组分在两相间的分配为分 离机理的电动色谱过程。 第三节 蛋白质含量的测定方法 n测定蛋白质含量的方法较多 n基本上都是根据蛋白质的理化性质和生物 学活性建立起来的。 目前常用的有四种古老的经典方法:定氮法,双缩脲法( Biuret法),Folin -酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法.另 外还有一种近十年才普遍使用起来的新测定方法,考马斯亮 蓝法( Bradford法).其中Bradford 法和 Lowry 法灵敏度 高,比紫外吸收法高10-20倍,比 Biuret 法高100倍以上. 凯氏定氮法比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白 质作为其他方法的标准蛋白质。 一、凯氏定氮法 凯氏定氮法的原理基于蛋白质的平均含氮量为16%, 通过测定样品中氮元素的量来计算出蛋白质的含量。 基本操作过程: 用硫酸对样品加热消化,蛋白质被硫酸氧化成CO2和H2O,氮元素被 还原成NH3 ,并形成(NH4)2SO4 ; 加入强碱,使硫酸铵释放出NH3,并将NH3收集在无机酸液
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