华中科技大学 博士学位论文 肿瘤抑制基因RECK对骨肉瘤侵袭生物学行为影响的研究 姓名：徐亮 申请学位级别：博士 专业：骨科学 指导教师：杨述华 20090401 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 肿瘤抑制基因 RECK 对骨肉瘤侵袭 生物学行为影响的研究 中中 文文 摘摘 要要 第一部分 肿瘤抑制基因 RECK 在骨肉瘤组织中表达的初步研究 肿瘤抑制基因 RECK 在骨肉瘤组织中表达的初步研究 目的 目的 通过检测 RECK 基因在人骨肉瘤组织中的表达， 探讨 RECK 基因在骨肉瘤 发生及转移过程中的作用。 方法 方法 采用免疫组化学方法检测 38 例骨肉瘤组织标本及 38 例正常骨组织中 RECK 蛋白的表达水平。 结果结果 38例骨肉瘤组织中有26例RECK蛋白呈弱表达或未见表达，而在所38例 正常的骨组织标本中RECK均有表达且呈强表达，骨肉瘤组织、正常骨组织中RECK 的吸光度值分别为(0.310.07)和(0.580.08)，骨肉瘤组织RECK的表达明显低于 正常骨组织（P0.01） ，差异具有统计学意义；RECK 蛋白表达与患者年龄、性别、 肿瘤大小、病理分级等均无密切关系，而RECK的低表达或不表达与肺转移有关（P 0.05, P = 0.019）。 生存资料分析显示, RECK蛋白高表达患者的平均生存时间为31个月,低表达患者 的平均生存时间为 15 个月,经 Log-rank 检验,RECK 高表达患者与低表达患者的累计 生存率差异有统计学意义（ P0.05，P = 0.032）。 结论结论 RECK 基因异常低表达可能参与骨肉瘤侵袭、转移机制，RECK 基因可能 成为判断骨肉瘤患者预后新的分子标志物及肿瘤治疗的新靶点。 1 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 第二部分 转染 RECK 基因对人骨肉瘤细胞 MMP-2 活化及侵袭 转染 RECK 基因对人骨肉瘤细胞 MMP-2 活化及侵袭 能力的影响研究 能力的影响研究 目的 目的 观察转染RECK 基因对人骨肉瘤胞系MG-63的MMP-2活化及细胞侵袭力 的影响。 方法 方法 以脂质体 Lipofectamine 2000 介导的方法将含 RECK 全长基因的真核 重组表达质粒 pcDNA3-RECK 转染入 MG-63 细胞。RT-PCR、Western blot、流式细胞术 检测目的基因的表达；明胶酶谱法、Matrigel 侵袭实验分别检测 MG-63 细胞上清的 MMP-2 活化比例及细胞侵袭力变化；四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法和细胞生长曲线法 观察质粒 DNA 转染对细胞的毒性情况。 结果 结果 转染后 RECK 基因在 MG-63 细胞 mRNA 和蛋白水平分别有稳定独立表达； 明胶酶谱结果显示， 正常对照组与空载质粒转染组细胞的MMP-2活化比例分别为(0.72 0.11),(0.800.14)，二组间差异无显著性意义；重组质粒转染组 MMP-2 活化比例 为(0.230.03)，与正常对照组、空载质粒转染组比较明显降低，差异有显著性意义 （均P0.01） 。Matrigel 侵袭实验结果显示：正常对照组与空载质粒转染组的穿至 微孔膜下表面的细胞数分别为(28.182.15)和(30.252.23)， 两组间差异无显著性 意义（P0.05） 。重组质粒转染组穿透 Matrigel 至微孔膜下表面的细胞数为(14.20 1.26)，明显低于正常对照组、空载质粒转染组，差异有显著性意义（均P0.05） 。 而 MTT 法测重组质粒转染组细胞生长曲线与空白对照组、 空载质粒转染组无明显差异 （均P0.05） 。 结论结论 RECK 基因过表达可显著减少骨肉瘤细胞 MG-63 的 MMP-2 活化及其侵袭 能力，RECK 基因可能成为肿瘤治疗的新的靶点。 关键词关键词 RECK 基因； 骨肉瘤； 基质金属蛋白酶； 转染 2 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 Study of the tumor inhibitory gene RECK on the invasional biologic behavior of osteosarcoma Abstract Part one The preliminary study on the expression of the tumor inhibitory gene RECK in the osteosarcoma tissues Objective To detect the the expression of RECK gene in osteosarcoma tissues explore its possible roles on the occurrence and metastasis of osteosarcoma. Methods The expression level of RECK protein in 38 osteosarcoma tissues and 38 normal bone tissues were detected by immunohistochemistry. Results Of the 38 osteosarcomas examined, 26 were stained weak or negative for RECK, whereas the strong RECK staining was observed in all 38 normal bone tissues. The absorbent optical density value of RECK protein in osteosarcoma tissues and normal bone tissuses were (0.310.07) and （0.580.08） ,respectively. The expression of RECK in osteosarcoma tissues was significantly lower than that in normal bone tissuse(P0.01). RECK protein expression was significant correlated with the pulmonary metastasis( P 0.05, P = 0.019）, but had no correlation with age, sex ,tumor size and pathologic grades. In a comparison between the patients with RECK-positive tumors and patients with RECK-negative tumors, the survival time of the RECK-positive group was found to be 31 months, whereas that of the RECK-negative group was 15 months, indicating the RECK-positive group had significantly better survival rate than the RECK-negative group (P0.05,P =0.032 by Log-rank test). Conclusion The abnoamal low expression of RECK may participate in osteosarcoma invasion and metastasis, and may be a new prognostic molecular marker for osteosarcoma 3 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 and a new therapeutic target for tumor. Part two The study of transfecting RECK gene on MMP-2 activation and invasional ability of human osteosarcoma cell Objective To investigate effect of transfecting RECK gene on MMP-2 activation and invasional ability of human osteosarcoma cell line MG-63. Methods The recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3-RECK inserted by the full length cDNA encoding human RECK gene was stably transfected into MG-63 by Lipofectamine 2000. RT-PCR,western blot and flow cytometric analysis were used to assay RECK gene expression.MMP-2 activation ratio of the cell supernatant and cell invasional ability of MG-63 were analyzed by gelatinase zymography and matrigel invasion assay, respectively.The cytotoxicity of plasmid DNA transfection on MG-63 cells were determined by MTT assay and cell growth curve method. Results The stable and higher expression of RECK in mRNA and protein level were detected in MG-63, respectively . Gelatinase zymography showed MMP-2 activation ratio in transfecting blank plasmid group and normal control group were (0.720.11),(0.800.14).No significant difference was found between them.However,the MMP-2 activation ratio in transfecting recombinant plasmid group was (0.230.03),which was obviously less than those in transfecting blank plasmid group and normal control group(both P value0.01). Mrtrigel invasion assay showed cell number invading through Matrigel in transfecting blank plasmid group and normal control group were (28