类号 密 级 UDC 保密期限 博 士 学 位 论 文博 士 学 位 论 文 题 目 结核分枝杆菌ESX-1 分泌蛋白调控巨噬细胞功能的研究 作者姓名 屈 野 指导教师 陈薇 研究员 徐俊杰 研究员 培养单位 生物工程研究所 专业名称 微生物学 论文提交日期 2013 年 05 月 20 日 学位授予单位 中 国 人 民 解 放 军 军 事 医 学 科 学 院 答辩委员会主席 中 国 人 民 解 放 军 军 事 医 学 科 学 院 制中 国 人 民 解 放 军 军 事 医 学 科 学 院 制 目 录目 录 缩略词表 - 1 中文摘要 - 5 英文摘要 - 9 前 言 - 13 第一部分 表达结核分枝杆菌 ESAT-6 与 EspB 的小鼠巨噬细胞系的建立-19 第二部分 表达结核分枝杆菌 ESAT-6 与 EspB 的重组 BCG 的构建-33 第三部分 ESAT-6 调控巨噬细胞吞噬功能的研究-45 第四部分 ESAT-6 调控巨噬细胞凋亡的研究-63 第五部分 EspB 调控巨噬细胞吞噬体成熟的研究-75 讨 论 -87 结 论 -89 参考文献 -91 附 录 -95 综 述 -99 论 著 -105 个人简介 -113 致 谢 -115 主 要 缩 略 词 表主 要 缩 略 词 表 英文缩写英文缩写 英文全名英文全名 中文译名中文译名 A absorbance 吸光度 BCG Bacille Calmette Guerin 卡介苗 bp base pair(s) 碱基对 Caspase-3 cysteine-containing aspartate-specific proteases 3 细胞凋亡蛋白酶 3 CFP-10 culture filtrate protein of 10 kDa 培养物滤过蛋白-10 DMEM Dulbecco modified Eagle medium 杜尔伯科改良伊格尔培养 基 dNTP deoxyribonucleotide triphosphate 脱氧核糖核苷三磷酸 E.coli Escherichia coli 大肠杆菌 EGFP enhanced green fluorescent protein 增强型绿色荧光蛋白 ELISA enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附试验 ERK 1/2 extracellular signal-regulated kinase1/2 细胞外信号调节激酶 1/2 ESAT-6 early secreted antigenic target-6 早期分泌抗原靶蛋白-6 EspB ESX-1 secretion-associated protein B ESX-1分泌相关蛋白B EspBN N terminal of EspB（50kDa） EspB的N端（50kDa） ESX-1 ESAT-6 system 1 ESAT-6系统1 FITC fluorescein isothiocyanate 异硫氰酸荧光素 FCS Fetal Calf Serum 胎牛血清 HBSS Hanks balanced salt solution Hanks平衡盐溶液 h hour(s) 小时 His histidine 组氨酸 HRP horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶 1 主要缩略词表 - 2 - IFN- Interferon 干扰素 IL-12 Interleukin-12 白介素 12 IPTG isopropylthio-D-galactoside 异丙基硫代半乳糖苷 kDa kilodalton 千道尔顿 LB Luria-Bertain broth LB 培养基 LDH lactate dehydrogenase 乳酸脱氢酶 LPS lipopolysaccharide 脂多糖 MAPK mitogen-activated protein kinase 有丝分裂原活化蛋白激酶 MEM minimal essential medium 最低必需培养基 min minute(s) 分钟 mL millilitre 毫升 MOI Multiplicity of Infection 感染复数 M.tb Mycobacteria tuberculosis 结核分枝杆菌 nM nanomole 纳摩尔 OD optical density 光密度 PAGE polyacrylamidegel electrophresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳 PBS/T phosphate-buffered saline/tween20 磷酸盐缓冲液/吐温20 PCR polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 pET21-ESAT-6 pET21a+ plasmid expressing ESAT-6 表达ESAT-6的pET21a+质 粒 pET21-EspB pET21a+ plasmid expressing EspB 表达EspB的pET21a+质粒 rBCG-E6 recombinant BCG expressing intracellular ESAT-6 细胞内表达ESAT-6的重组 BCG rBCG-SE6 recombinant BCG expressing secreted ESAT-6 分泌表达ESAT-6的重组 BCG 主要缩略词表 - 3 - rBCG-EB recombinant BCG expressing intracellular EspB 细胞内表达EspB的重组 BCG rBCG-EN recombinant BCG expressing secreted EspBN 分泌表达EspBN的重组 BCG RAW-flag-E6 RAW264.7 cell line expressing flag-ESAT-6 fusion protein 表达flag-ESAT-6融合蛋白 的RAW264.7细胞系 RAW-flag-EGFP RAW264.7 cell line expressing flag-EGFP fusion protein 表达flag-EGFP融合蛋白 的RAW264.7细胞系 RAW-flag- EspBN RAW264.7 cell line expressing flag-EspBN fusion protein 表达flag-EspBN融合蛋白 的RAW264.7细胞系 RAW-E6 RAW264.7 cell line expressing EGFP-ESAT-6 fusion protein 表达EGFP-ESAT-6融合蛋 白的RAW264.7细胞系 RAW-EGFP RAW264.7 cell line expressing EGFP protein 表 达 EGFP 蛋 白 的 RAW264.7细胞系 RAW-EspB RAW264.7 cell line expressing EGFP-EspB fusion protein 表达EGFP-EspB融合蛋白 的RAW264.7细胞系 RAW- EspBN RAW264.7 cell line expressing EGFP-EspBN fusion protein 表达EGFP-EspBN融合蛋 白的RAW264.7细胞系 RD-1 region of difference-1 差异区域-1 rpm round per minute 转/分钟 SDS sodium dodecylsulfate 十二烷基硫酸钠 sESAT-6 ESAT-6 gene with signal sequence 有信号序列ESAT-6基因 TAE Tris/acetate/EDTA buffer Tris/乙酸/EDTA缓冲液 TB tuberculosis 结核 TBS/T Tris-Buffered Saline /Tween 20 Tris盐/ Tween 20缓冲液 TE Tris/EDTA buffer Tris/EDTA缓冲液 TLR2 Toll-like receptor 2 Toll样受体2 g microgramme 微克 L microliter 微升 主要缩略词表 - 4 - 中文摘要 - 5 - 结核分枝杆菌 ESX-1 分泌蛋白调控巨噬细胞功能的研究 近些年研究证实，ESX-1 蛋白分泌系统与结核分枝杆菌在巨噬细胞中存活、生长繁 殖及致病密切相关，是结核分枝杆菌的一个重要毒力因子。现已确认，ESX-1 系统可分 泌多个结核分枝杆菌蛋白，这些分泌蛋白存在共分泌现象，缺失其中某种蛋白就会影响 其他蛋白的分泌，同时导致结核分枝杆菌毒力及致病性的显著下降，因此通过基因敲除 和过表达去单独