分类号：R730.2 单位代码：10335 密 级： 学 号：20718048 硕 士 学 位 论 文 硕 士 学 位 论 文 中文论文题目：中文论文题目：胃腺癌中神经内分泌细胞克隆性起源 及临床病理意义的研究 胃腺癌中神经内分泌细胞克隆性起源 及临床病理意义的研究 英文论文题目：英文论文题目：Clonality analysis of neuroendocrine cells in gastric adenocarcinoma and clinicopathologic significance 申请人姓名：王王 玲玲 玲玲 指 导 教 师：姚姚 根根 有有 专 业 名 称：病理学与病理生理学病理学与病理生理学 研 究 方 向：肿瘤病理肿瘤病理 所 在 学 院：医医 学学 院院 论文提交日期论文提交日期2010 年年 1 月月 胃腺癌中神经内分泌细胞克隆性起源胃腺癌中神经内分泌细胞克隆性起源 及临床病理意义的研究及临床病理意义的研究 论文作者签名论文作者签名: 指导教师签名指导教师签名: 论文评阅人 1：欧阳宏伟教授浙江大学医学院 评阅人 2：胡虎副教授浙江大学医学院 评阅人 3：赵再秋副主任医师浙江省新华医院 评阅人 4： 评阅人 5： 答辩委员会主席：周韧教授浙江大学医学院 委员 1：赵仲生主任医师浙江省人民医院 委员 2：徐如君主任医师杭州市第一人民医院 委员 3： 委员 4： 委员 5： 答辩日期：2010 年 3 月 3 日 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果， 也不包含为获得 浙江大学浙江大学 或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 浙江大学浙江大学 有权保留并向国家有关部门或机构 送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权 浙江大学浙江大学 可以 将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 （保密的学位论文在解密后适用本授权书） 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日 浙江大学硕士学位论文 致谢 I 致 谢 致 谢 时光飞逝，岁月如梭，短暂的研究生学习及科研阶段即将结束，回忆起在此 期间的点点滴滴，心中有无限的感慨。科研期间的耕耘和汗水使我终生受益。我 想在此对所有关心过我、帮助过我的人表达我最诚挚的谢意。 首先衷心感谢我的导师姚根有教授在学习、科研以及生活各方面给予的谆谆 教诲和无微不至的关怀。从初始科研课题的设计，实验的过程以及论文的撰写中， 无不倾注了姚老师的心血和汗水。是导师为我指点迷津，帮助我开拓研究思路， 给予我精心点拨、热忱鼓励。姚老师对待科研一丝不苟的态度，严谨求实、兢兢 业业的工作作风，时时刻刻激励着我们不断努力向前，这一切都值得我终生学习 和铭记。 衷心感谢赵仲生老师、周韧老师在实验上的指导与支持，感谢师姐汤绚丽、 张布衣、徐芳英在实验上给予的无私的帮助，感谢危晓莉老师、杨水友老师、张 秀明师兄在实验以及生活上提供的热情帮助! 同时我也要感谢病理学实验室同学们，申秀锦、赵菁、朱林静、王海兵、张 海勇，感谢你们在工作、学习和生活中给予我的帮助和支持。 感谢评审专家及答辩委员会的专家们！ 感谢父母在我漫漫求学路上对我的理解、支持和鼓励！ 感谢所有关心、支持我的朋友们！ 浙江大学硕士学位论文 摘要 II 胃腺癌中神经内分泌细胞克隆性起源及临床病理意义的研究胃腺癌中神经内分泌细胞克隆性起源及临床病理意义的研究 浙江大学医学院浙江大学医学院 病理学与病理生理学病理学与病理生理学 硕士研究生硕士研究生 王玲玲王玲玲 导导 师师 姚根有姚根有 中文摘要 中文摘要 胃癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一。普通型胃腺癌伴神经内分泌 分化，是指胃腺癌中出现分化的神经内分泌（NE）细胞，但其数目在癌组织成分 中所占比例较小， 不足 50%， 并且这些分化的 NE 细胞多以单个或者细胞巢的形式 分散存在。我们以往的研究结果显示，大肠腺癌、胃腺癌、前列腺癌、乳腺癌及 胰腺癌中 NE 细胞的发现率分别为 41.5%，39.6%，38.1%，21%和 17.9%，并发现 在大肠癌、前列腺癌、乳腺癌及胰腺癌中，高分化腺癌 NE 细胞的发现率明显高于 低分化腺癌，而胃癌则相反，低分化腺癌中 NE 细胞的发生现率明显高于高分化腺 癌。这些差异性是否与肿瘤所在部位的胚胎起源、肿瘤病因学、组织发生学的不 同及遗传学改变有关，仍处于探索研究阶段。因此，通过分子生物学的方法认识 NE 细胞的性质，有助于更深入的认识胃癌发生、发展的机理，并为临床诊断和治 疗提供依据。 目前国内外对非神经内分泌肿瘤中NE细胞的研究较少，特别是用分子遗传学 方法研究普通型胃腺癌中单个NE细胞的起源方面尚未见报道。 关于胃腺癌中NE分 化的发生机制存在许多不同的假说，多数学者认为NE细胞和上皮细胞均来源于内 胚层多潜能干细胞。在肿瘤发生及演进过程中，内胚层的多潜能干细胞受激素、 局部微环境及基因组不稳定性的影响，使某些被抑制的基因组密码发生随机脱抑 制，在RNA水平选择性激活两种以上调节机制，最终导致基因产生双向或多向分 化。然而，这些推测仅建立在形态学观察的基础之上，缺乏可靠性。这些散在的 浙江大学硕士学位论文 摘要 III NE细胞是否存在基因水平的改变，它们是肿瘤的实质成分，还是仅仅作为肿瘤的 间质成分存在，尚无明确定论。激光捕获显微切割技术（Laser capture microdissection, LCM）可以使研究者可以获得形态完整的单一细胞或细胞群进行 遗传学研究，解决了目的细胞的捕获难题。由于该技术在切除和提取细胞过程中 不产生热量，对目的细胞没有任何损伤，即避免了邻近细胞的污染，又不会损伤 DNA、RNA。目前国际上很多研究，其样本的获取都是利用了LCM技术。DNA Micro-kit试剂盒可以对微量组织或LCM捕获的细胞进行DNA抽提，联合应用 Repli-g扩增试剂盒进行全基因组扩增，可以获得足量DNA用于后续的实验研究。 野生型 p53（wt-p53）作为抑癌基因，在正常组织中参与了细胞周期调控、细 胞凋亡等过程，发生突变或缺失时，将丧失上述功能，使细胞增殖失控，凋亡受 阻，从而引发肿瘤。错配修复功能的完整是细胞 DNA 准确复制和基因组稳定的基 本保证。该功能缺失与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。MLH1 基因是错配修 复基因家族的重要成员之一，具有修复 DNA 碱基错配，增强 DNA 复制忠实性， 维持基因组稳定性降低自发性突变的功能。E-cadherin（上皮型钙粘蛋白）是一种 介导同种细胞相互黏附的钙依赖性跨膜糖蛋白，对细胞极性的建立，维持上皮细 胞正常形态至关重要。抑癌基因 PTEN 在正常组织中参与了 DNA 损伤修复、细胞 周期调控、细胞凋亡、细胞间相互作用及抑制血管生成等过程。当 PTEN 发生突 变或缺失时，将丧失上述功能，不但减少对细胞凋亡的调控，还可以促进细胞进 入增殖周期，导致细胞的无限增殖。干细胞在分化过程中，染色体有丝分裂不均 衡，可造成部分基因在两种分化的细胞中同时出现等位基因的改变（如增益、丢 失、突变等），通过对微卫星改变（包括微卫星不稳定和杂合性丢失）及突变、 CGH 等的检测可推测组织细胞的克隆性来源。我们在全基因组范围内选取多个微 卫星位点，联合 p53 突变检测，对普通型胃腺癌 NE 细胞进行分子水平上的研究， 以期明确 NE 细胞的克隆性起源。我们制备了组织芯片，联合应用免疫组化方法检 测 CGA、p53、MLH1、E-cadherin、PTEN 等 5 个指标在胃癌中的表达情况，结合 随访资料， 综合分析上述指标的表达与伴有 NE 分化胃癌的临床病理参数及预后的 关系，为胃癌的诊断及预后评估提供理论指导。 浙江大学硕士学位论文 摘要 IV 材料和方法材料和方法 本实验收集浙江省人民医院 20012003 年间胃腺癌及正常胃粘膜新鲜标本 120 例。首先用冰冻切片嗜铬粒蛋白 A（Chromogranin A, CgA）免疫组化方法对 上述标本进行初筛，确定含 NE 细胞较多的组织，经红外线激光捕获显微切割获取 500 个左右单个 NE 细胞， 应用 DNA Micro-kit 抽提试剂盒及 Repli-g 全基因组扩增 试剂盒进行 DNA 抽提和全基因组放大，全基因组范围内选取 26 个微卫星位点， 结合 PCR-SSCP-银染色检测 NE 细胞和腺癌细胞微卫星改变情况，联合 PCR-测序 检测基因 p53 突变发生情况，推测胃腺癌中 NE 细胞的克隆性起源。收集浙江大学 医学院附属第一医院和绍兴市人民医院手术切除胃癌标本共 220 例，另取 31 例同 期非肿瘤胃黏膜组织作为对照。 制备组织芯片， 联合应用免疫组化检测 CGA、 p53、 MLH1、E-cadherin、PTEN 等 5 个指标在胃癌中的表达情况，结合随访资料，综合 分析上述指标的表达与伴有 NE 分化胃癌的临床病理参数及预后的关系。 结果结果 1、免疫组化激光捕获显微切割：120 例胃腺癌新鲜组织中，含有中大量 NE 细胞的占 25.0%（30/120），在 20 倍物镜下捕获腺癌中单个 NE 细胞 500 个左 右。 2、微卫星分析结果：30 例样本中 MSI 总发生率为 27.4%，LOH 总发生率为 17.9%，各样本 MSI 发生率高于 LOH。从不同细胞微卫星改变发生率比较，NE 细胞与腺癌细胞发生率无明显差异。各样本 MSI 及 LOH 发生率与胃癌的临床病 理参数之间无明显相关性。从两种细胞 LOH 及 MSI 一致性来看，例 2、3、5、6、 11、12、18、24、27、30 在 NE 细胞和腺癌细胞中发生了完全一致的微卫星改变， 其余样本除例 7 和 10 外，其他 18 例微卫星改变的差异无统计学意义。 3、p53 突变结果：30 例样本中 NE 细胞和腺癌细胞 p53 突变主要集中在外显 子 7 和 8，从 p53 突变的一致性上看，样本 4、14、21、27 的 NE 细胞和腺癌细胞 均发生了外显子 7、8 的一致性突变，例 7 的两种细胞突变不一致，例 17 仅腺癌 细胞发生了突变。腺癌细胞 p53 突变有 6 例（20.0%），NE 细胞 p53 突变有 5 例 （16.7%）。临床病理资料显示多为浸润性低分化腺癌，TNM 分期为 III-IV 期。 浙江大学硕士学位论文 摘要 V 统计学分析显示 p53 突变与胃腺癌分化程度、TNM 分期、血管浸润和淋巴结转移 相关（P1.5 计为不完全不平衡（incomplete imbalance） ，密度比3 计为完全不平衡（complete imbalance） 。将不完全及完全不平衡条带计为 LOH 阳 性18。仅出现一条条带者为纯合子，在统计杂合性丢失时计为非信息分子 （noninformative molecule, N） 。 3.2.14 p53 突变检测突变检测 聚丙烯酰胺凝胶电泳银染出现异常（与正常对照相比，条带发生移