毛鸡骨草体外对HBsAg和HBeAg的抑制作用 作者：陈晓白 韩余健 许潘健 甘耀坤 王晓平 赵仕花【摘要】 目的观察毛鸡骨草在体外对HBsAg和HBeAg的抑制作用。方法将毛鸡骨草醇提取液与等容量、滴度为164的HBsAg和HBeAg阳性血清混合,使混合后毛鸡骨草的浓度分别为96，48，24，12和6 g/L，用磷酸缓冲液与164的HBsAg和HBeAg阳性血清混合作空白对照。每组6管， 37水浴8 h和16 h后，采用ELISA法测定HBsAg和HBeAg的OD值，观察其对HBsAg或HBeAg的抑制作用。结果毛鸡骨草醇提取液对血清中HBsAg和HBeAg 均具有抑制作用，可使HBsAg和HBeAg的浓度降低，呈现一个明显的量效和时效反应关系。其中毛鸡骨草在作用16 h，浓度为96，48 g/L时对HBsAg，HBeAg抑制作用最为明显（P0.05）。结论毛鸡骨草在体外有较明显的抗HBsAg和HBeAg作用。 【关键词】 毛鸡骨草 乙型肝炎表面抗原（HBsAg） 乙型肝炎E抗原（HBeAg） 抑制鸡骨草Abrus cantoniensis Hance和毛鸡骨草Abrus m ollis Hance为豆科相思子属植物,是常用的中药材，亦是我国出口中草药品种之一1。具有清热解毒、利湿、活血化瘀、舒肝止痛等功效，临床上多以复方入药,可用于黄疸、胁肋不舒、胃脘胀痛、急慢性肝炎、乳腺炎等症，特别是在肝胆疾病治疗方面应用广泛，并取得较好的效果。中国的广东、广西等地有丰富的鸡骨草资源，广西玉林制药有限责任公司生产的保肝护胆良药“鸡骨草胶囊”就是以毛鸡骨草为主要原料。为了更好地开发、利用广西这一丰富的中草药资源，进一步明确毛鸡骨草抗肝炎病毒的作用，为临床治疗病毒性肝炎提供更确切的理论依据，本文采用体外研究方法，以乙肝病人血清为研究对象，采用酶联免疫吸附实验(ELISA)技术，观察毛鸡骨草在体外对HBsAg和HBeAg的抑制作用。1 材料与仪器1.1 药物与试剂毛鸡骨草由广西玉林制药有限责任公司提供；HBsAg检测试剂盒（酶联免疫吸附试验；ELISA），批号：200706003；HBeAg检测试剂盒（酶联免疫吸附试验；ELISA），批号：200708008。 HBsAg检测试剂盒和HBeAg检测试剂盒均为北京科卫临床诊断试剂生物技术有限公司产品。乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒E抗原（HBeAg）阳性血清6份，由广西玉林市红十字会医院检验科提供。1.2 仪器与设备RT2100C型酶标仪（深圳雷杜生命科学服务公司生产）；RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。2 方法2.1 毛鸡骨草醇提取液的制备将30 g毛鸡骨草粉末放于索氏提取器中，加300 ml质量分数为0.75的乙醇在90水浴中回流提取3 h，取出提取液，再次用300 ml质量分数为0.75的乙醇在90水浴中回流提取3 h，合并提取液，用旋转蒸发仪将提取液浓缩至10 ml，使样品液浓度为3 g/ml。2.2 ELISA(酶联免疫吸附实验)法定量检测HBsAg和HBeAg参考文献2，3。取乙型肝炎病人血清6份，用磷酸缓冲液（PBS）按12将血清作倍比稀释，ELISA方法测定原血清及不同稀释度血清样品的HBsAg和HBeAg含量(吸光度：OD)，被测血清样品OD值阴性血清对照OD值的2.1倍时为阳性血清。选择HBsAg和HBeAg滴度为164的阳性血清各6份。将毛鸡骨草醇提取液的pH值调至7.4，用PBS将毛鸡骨草醇提取液稀释为不同浓度的药液，将不同浓度的药液分别与等容量、滴度为164的阳性血清混合,使混合后的血清中毛鸡骨草的浓度分别为96，48，24，12和6 g/L，从而分为A组（96 g/L）、B组（48 g/L）、C组（24 g/L）、D组（12 g/L）、E组（6 g/L），用PBS与164血清混合作空白对照组，每组6管，即时放置37水浴中，用ELISA法测定各血清样品在8、16h的OD值。每份血清各测1次。 采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测，结果以抑制率表示。药物对抗原的抑制率（%）=1-给药组抗原OD值对照组抗原OD值1002.3 统计学处理数据采用SPSS11.5统计软件进行t检验，结果以s表示。3 结果3.1 毛鸡骨草在体外对HBsAg的抑制作用采用ELISA法，检测毛鸡骨草醇提取液在作用HBsAg滴度为1：64的肝炎血清8，16 h后血清中HBsAg的含量。与空白对照组相比较，毛鸡骨草醇提取液与肝炎血清作用8，16 h后，毛鸡骨草浓度为6，12，24，48，96 g/L时均对乙型肝炎血清中HBsAg 均具有抑制作用，可使乙型肝炎血清中HBsAg的浓度降低，且随着药物浓度和作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现一个明显的量效和时效反应关系。其中毛鸡骨草在作用16 h后、浓度为96、48 g/L对HBsAg具有较明显的抑制作用（P0.05），抑制率分别为35.7%，29.3%。结果见表1。表1 毛鸡骨草在体外对HBsAg的抑制作用（略）与空白血清组比较, *P<0.05；n=63.2 毛鸡骨草在体外对HBeAg的抑制作用采用ELISA法，检测毛鸡骨草醇提取液在作用HBeAg滴度为164的肝炎血清8,16 h后血清中HBeAg的含量。与空白对照组相比较，毛鸡骨草醇提取液与肝炎血清作用8,16 h后，毛鸡骨草在质量浓度为6，12，24，48，96 g/L时均对乙型肝炎血清中HBeAg 具有抑制作用，可使乙型肝炎血清中HBeAg的浓度降低，且随着药物浓度和作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现一个明显的量效和时效反应关系。其中毛鸡骨草在作用16 h，浓度为96，48 g/L对HBeAg具有较明显的抑制作用（P0.05），抑制率分别为35.2%，32.4%。结果见表2。表2 毛鸡骨草在体外对HBeAg的抑制作用（略）与空白血清组比较, *P<0.05；n=64 讨论 乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起、以肝脏炎性病变为主的一种传染性疾病。血清中HBsAg阳性是HBV感染的标志。HBeAg 为HBV复制的重要指标，存在于乙肝表面抗原阳性血液中，HBeAg阳性反映病毒复制活跃、传染性强。目前，国内外医学界治疗乙型病毒性肝炎的抗病毒药物主要有干扰素和核苷类药物两大类，但其疗效均不够理想。寻找具有确切有效抗乙肝病毒药物已成为国内外学者研究的热点。我国传统医学博大精深，中医中药在治疗病毒性肝炎方面积累了丰富的经验并取得了一定的效果。不少中药、中药提取物及中药单体对乙肝病毒均有显著的抑制效果。毛鸡骨草就是目前研究比较多的一类。毛鸡骨草目前已经在临床上广泛使用，尤其在慢性病毒性肝病的应用中十分普遍，多以复方入药。传统医学认为毛鸡骨草具有清热解毒、利湿、活血化瘀、舒肝止痛等功效，现代药理研究表明鸡骨草有护肝、利胆、抗菌、抗炎、增强免疫作用。本研究以乙肝病人的血清为研究对象，观察了毛鸡骨草醇提取液在体外不同浓度和不同时间对HBsAg和HBeAg的抑制作用，结果表明，毛鸡骨草醇提取液对肝炎血清中HBsAg和HBeAg 均具有抑制作用，可使肝炎血清中HBsAg和HBeAg的浓度降低，且随着药物浓度和作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现一个明显的量效和时效反应关系。其中毛鸡骨草在作用16 h、质量浓度为96，48 g/L对HBsAg、HBeAg抑制作用最为明显（P0.05）。 药物抗病毒作用的研究方法有多种，本实验直接采用乙肝病人阳性血清为研究对象，与临床实际比较贴近。虽然体外实验与体内实验的结果有一定的差异，体外实验不能完全反映药物体内的真实效果，但此实验，在一定程度上可以说明毛鸡骨草对乙型肝炎病毒有直接的抑制作用。 本实验只是从某个角度证明毛鸡骨草抗肝炎病毒的作用，毛鸡骨草对乙肝病毒的作用还有待于采取不同研究方法、多角度进一步明确。【参考文献】 1 白隆华,董青松,蒲瑞翎.中药鸡骨草研究概况J.广西农业科学,2005,36(5):476.2 杨霞芳 ，荣延平，蒋伟哲.复方六月雪在体外对HBsAg和HBeAg的抑制作用J.广西医科大学学报,2004，21（4）：511.3 张士军，黄春喜，谢 海.复方六月雪对HepG2215细胞HBsAg和HBeAg的抑制作用J.中国医院药学杂志，2007， 27（6）:715.