实时荧光定量PCR技术在水稻氮素基因表达中的应用研究与展望 作者：李荣德 董芙蓉 范祥云 徐恺 邱杰 徐扬 黄丽芬摘要实时荧光定量PCR技术实现了对低拷贝基因表达量的快速、准确定量,综述了目前水稻氮素吸收利用相关基因的研究成果,展望了荧光定量PCR技术在水稻氮素相关基因表达中的应用前景。 关键词水稻;氮素;基因表达;荧光定量PCR;应用研究;展望 20世纪6070年代水稻矮化育种和杂交稻三系配套的成功和应用使水稻产量大幅度提高,但同时导致氮肥施用量的急剧增加。尽管氮肥在提高水稻产量的过程中起着非常重要的作用,但对地下水、土壤、河流、湖泊和大气等农业环境的污染严重,间接影响人体健康。目前在作物生产中氮素利用率较低,只有28%40%1,而水稻是我国第一大粮食作物,因此如何提高水稻氮素利用率,是当前亟需攻克的重要课题。笔者介绍荧光定量PCR技术在水稻氮素基因表达中的研究应用,以期在基因水平上为水稻育种提供一种方法。 1水稻与氮素的关系研究 1.1氮在水稻生产中的作用 世界上许多地区的水稻生产越来越注重于优化籽粒产量、降低生产成本、减少对环境的污染危害2。限制水稻生产的投入之一是氮,氮素对水稻是重要的,约75%的叶片氮与叶绿体有关,而后者通过光合作用在干物质生产中发挥着重要的生理作用。在营养生长期水稻吸收氮素促进生长和分蘖,从而决定潜在的穗数;在穗形成初期氮素有利于小穗的形成;而在穗形成后期,则通过减少退化小穗数增加谷壳大小而增加库容。氮素在抽穗前增加了茎和叶鞘中碳水化合物的积累,而在籽粒灌浆中则有助于增加籽粒中碳水化合物的积累。 1.2水稻氮肥吸收利用率现状 长期以来大量施用氮肥一直是稳定和提高水稻产量的重要措施,因不断增加水稻植株中的氮素含量导致回报率降低,并不是总能增加水稻产量,因此从经济方面考虑这一措施并不总是最优的。同时,过量施用氮肥还会对环境和人体健康产生潜在的不利影响,并增加病害的发生和倒伏。水稻的种植容易导致氨挥发、硝化-反硝化脱氮、淋溶以及径流而使氮素丢失。基于此,国内外越来越重视研究和改良水稻氮素吸收利用的遗传潜力和生理机制,建立高效生产技术体系,从根本上提高水稻对氮素营养的吸收利用。我国的氮肥吸收利用率为30%35%,低于世界平均水平。我国与日本的水稻单产水平大致相当,但单位施氮的产谷效益不足日本的1/2。根据李荣刚报道,江苏省水稻的氮肥吸收利用率仅为19.9%,显著低于全国平均水平,如此低的氮肥吸收利用率主要是由于江苏稻农氮肥施用量过高所致。 1.3水稻氮素利用效率与高氮素利用水稻品种 提高水稻养分利用效率尤其是氮素利用效率的研究正在全球兴起。水稻利用氮素的效率包括氮吸收效率和氮利用效率。植物氮吸收量与供氮量之比为氮吸收效率;而籽粒产量与氮吸收之比为氮素利用效率。近些年开始强调氮高效水稻育种,并不是对水稻育种40余年所取得的育种成果的否定,而是在节约资源和保护环境背景下对水稻育种工作提出的新的要求;并不是一味追求氮素利用效率而牺牲对高产要求,而是较高的产量水平下的高氮素利用效率。在现有的推广品种中就存在产量高、氮素利用效率高的“双高”基因型的品种。 2水稻氮素吸收利用的相关基因 植物氮素营养作用是一个非常复杂的过程,氮效率的遗传力、控制基因的数目、基因间的相互作用等问题仍不十分明确,如何选择氮素高效率基因型一直是研究者们探索的重点。近年来,分子生物学技术的发展,为作物遗传与育种工作提供了新的手段。迄今,在分子水平上对不同形式的氮素转运蛋白及氮代谢相关酶类的研究有了很大的进展3。许多有关氮代谢酶基因被鉴定和克隆,为用生物工程的方法提高氮效率提供了有效的途径。 2.1氮素吸收相关基因 虽然高等植物可以利用有机态的氮,但根系主要吸收的氮源还是NO3- 和NH4+。近年来,人们从分子水平上对硝态氮的吸收系统进行了大量研究。已发现2 种基因NRT1 和NRT2 与硝态氮转运系统(HATS 和LATS)有关。目前已从多种作物中克隆了硝态氮低亲和系统的基因。越来越多的证据表明,铵高亲和转运体应是AMT1 家族的成员,原因是AMT 蛋白在植物根系吸收土壤氮素中起主要作用。如在拟南芥根系中,AtAMT1;1、AtAMT1;2和AtAMT1;3 基因都有充分的表达,而且通过调节这些基因,改变了根系对铵的吸收活力。植物中第1个被发现的AMT1 基因是拟南芥中的AtAMT1;3,用核DNA 消减法也从酵母铵运转体缺陷型突变体中克隆了此基因。AtAMT2基因在拟南芥的所有器官中都有表达,受氮素的调节,在根系的表达部分受到高浓度硝酸铵的抑制。在地上部分,AtAMT2的表达基本不受根部氮素状态的调节;所以在植物体的所有细胞中,AtAMT2在铵从质外体到共质体的运输中可能有重要作用。 2.2氮素利用基因 谷氨酰胺合成酶GS是参与植物氮代谢的关键酶。高等植物中编码GS的基因的表达是一个十分复杂的过程,而且因植物种属的不同而呈差异表达。植物发育进程以及光照、氮源的形式、水分、NaCl等外界因子均影响GS基因的表达。作物在吸收氮素的过程中具备1套酶系统,能有效地将氨转化为氨基酸,进而同化为蛋白质。氨基酸的合成是通过GS和谷氨酸合成酶(GOGAT)的偶联作用,同时有各种氨基转移酶参加完成。GS、GOGAT 在植物叶片、根瘤以及根中均有分布3,但在不同器官中GS/ GOGAT 循环的作用不尽相同。在绿色组织中,GS/ GOGAT 循环的主要作用是同化光呼吸产生的NH4+ 以及硝酸盐在叶中还原产生的NH4+,在根瘤中则主要同化根瘤菌固氮 产生的NH4+,而在根中则是同化吸收到体内的NH4+ 以及硝酸盐被吸收后在根中还原产生的NH4+。高等植物体内95%以上的NH4+通过GS/ GOGAT循环同化合成氨基酸,从而实现对所吸收的氮素的利用。 综上所述,在目前已知的氮素吸收系统相关基因主要有4类:铵吸收基因AMT、硝吸收基因NRT、GS基因和GO GAT基因。 3荧光定量PCR技术及其应用 3.1荧光定量PCR技术优点 传统PCR 可对特定核苷酸片段进行指数级扩增。在扩增反应结束之后,可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性分析,也可以通过对光密度扫描来进行半定量分析。但是无论定性还是半定量分析,分析的都是PCR 终产物,不能确保PCR 产物信号与初始模板的拷贝数成比例。由于吸收基因表达量很低,很难进行精确定量,实时荧光定量PCR技术实现了对低拷贝基因表达量的快速、准确定量。 实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR)4是在传统PCR技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术,它有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,测得未经PCR信号放大之前的起始模板量。其反应体系中,引入了一种荧光化学物质,随着PCR反应的进行,PCR 反应产物不断累加,荧光信号强度也等比例增加。这样就可以根据指数扩增期的产物荧光强度来推算初始模板的量。与传统PCR 方法相比,它具有定量准确可靠、灵敏度高、重复性好,而且操作简便、安全、快速等特点。实时荧光定量PCR从原理上有两大类荧光模式:一是荧光杂交探针,二是双链DNA内插染料。前一种方法特异性好,除需要合成序列特异引物外,还需要合成高成本的荧光探针,成本较高;后一种方法经济,使用方便,只需合成序列特异引物,没有序列特异性,可以用于不同的模板。但正是由于荧光染料可以和任何的双链DNA结合,因此DNA引物二聚体或其他非特异扩增产物可以对结果产生干扰。通过摸索优化反应条件和荧光捕捉点、建立简单实用的标准曲线、用溶解曲线和凝胶电泳证实等手段,解决或弥补DNA 结合染色的不足,成功建成了可检测DNA和mRNA的SYBRGreen实时荧光定量PCR 技术平台。实时荧光定量PCR技术已经成为实验室一种特异性、高敏感性的定量检测基因表达的有效方法。 3.2荧光定量PCR技术在水稻氮素基因表达中的应用 从分子生物水平上寻找提高植物氮素利用率的调控基因的研究还只有10多年的时间,其相关基因的时空表达调控特征,特别是生理功能还不是很清楚。目前有学者将研究的重点集中在部分与氮素代谢相关的基因上,李宝珍等5以粳稻品种武运粳7号为供试品种,研究了氮饥饿7d后,恢复供应不同形态氮源(NH4+、NO3-、NH4NO3)在0.596.0h对水稻氮的吸收和积累及氮还原同化中关键酶的生理差异和相关基因的调控,同时利用基因芯片对水稻恢复供应不同形态氮素4d后所调控表达的基因进行了分析,鉴定到一批受NH4+或NO3-特异诱导的基因上游序列的顺式调控元件和转录因子及其他可能影响氮素吸收和利用的功能基因。张启发实验室6在2006年利用包含11 494个水稻ESTs序列的cDNA芯片研究了水稻苗期在短时间(20120min)内低氮胁迫下响应的基因,研究表明,与正常氮处理比较,低氮胁迫响应的基因主要在水稻根系,叶片组织中没有检测到差异显著的基因。施卫明实验室也运用荧光定量PCR实验鉴定水稻苗期不同硝铵比例下氮素吸收代谢基因群的表达,从基因表达量水平较为全面地证明了水稻硝促铵原理7,8,但该研究只做了水稻幼苗期和单个水稻品种,而未证明水稻全生育期氮素基因表达的变化和品种之间的表达差异。 4荧光定量PCR技术在水稻氮素基因表达中的研究展望 采用实时荧光定量PCR 技术,通过使用特异引物,对水稻中NH4+吸收转运蛋白基因、NO3-转运蛋白基因、编码GS的基因和编码GOGAT的基因在转录水平上,进行了不同氮素利用基因型水稻品种在各个生育期、不同氮素水平下的表达量的定量分析9,10,成功建立了可检测水稻氮素吸收利用相关基因表达量实时荧光定量PCR 技术平台。该方法具有很好的准确性和实用性,可以为作物遗传育种建立筛选、农业合理施肥、保护生态环境提供精确的检测标准。 5参考文献 1 曹桂兰,张媛媛,朴钟泽,等.水稻不同基因型耐低氮能力差异评价J.植物遗传资源学报,2006,7(3):316-320. 2 崔世友,缪亚梅,史传怀,等.氮高效水稻育种研究及展望J.中国农业科技导报,2006,8(6):47-51. 3 王巧兰,吴礼树,赵竹青,等.植物氮素营养遗传研究进展J.湖北农业科学,2006,45(5):668-673. 4 赵首萍,赵学强,施卫明.不同铵硝比例对水稻铵吸收代谢基因表达的影响J.土壤学报,2006,43(3):436-442. 5 LI B Z,XIN W J,SUN S B,et al.Physiological and Molecular Responses of Nitrogen-Starved Rice Plants to Re-supply of Different Nitrogen SourcesJ.Plant and Soil,2006(287):145-159. 6 LIAN X M,WANG S P,ZHANG J W,et al. Expression Profiles of 10,422 Genes at Early Stage of Low Nitrogen Stress in Rice Assayed using a cDNA MicroarrayJ. Plant Molecular Biology,2006(60):617-631. 7 ZHAO X Q,SHI W M. Expression analysis of the glutamine syntheta