安徽 医科大学学报A c t a U n i v e r s i t a t i s Me d i c i n a l i s A n h u i 2 0 1 3 A p r ； 4 8 ( 4 ) 3 7 9 芸香苷对人晶体上皮细胞氧化损伤和凋亡保护作用的初步研究 喻亚梅 ， 周艳峰 摘要 目的 研究黄酮类化合物芸香苷( R u ) 对过氧化氢 ( H ： 0 ： ) 诱导的人晶体上皮细胞( H L E C) 氧化损伤和凋亡的 保护作用。方法用不同浓度 R u ( 0 、 2 5 、 5 0 、 1 0 0 Ix m o l L) 预 处理 H L E C 1 h ， 再加入 2 0 0 t z m o l L H 2 O 2 ， 分别检测各组细 胞增殖活性以及超氧化物歧化酶 ( S O D) 、 还原型谷胱甘肽 ( G S H) 、 丙二醛( MD A) 水平， 观察细胞凋亡形态并计算凋亡 指数( A I ) 。结果2 0 0 Ix m o l L H O 组 H L E C增殖能力及 S O D、 G S H含量较对照组显著下降， MD A和 A I 较对照组明 显增高( P 0 O 1 ) ； R u预处理组与 H 0 ：组相 比， 细胞生存 率 、 抗氧化水平 明显提高， 凋亡细胞数量显著减少 ( P9 8 ； 3 0 分析纯 H 2 0 2 ( 上海 中 试化工总公 司产 品) ； D ME M 培养液、 胎牛血清 ( 美 国 G I B C O B R L产 品) ； 0 2 5 胰蛋 白酶 ( 碧 云天生 物技术研究所产品) ； 3 ( 4 ， 5 一 二 甲基噻唑 2 ) - 2 - 5 二 苯基四氮唑溴盐 ( M1 _ r ) 、 二 甲基亚砜 ( D MS O) 均为 美国 S i g ma 公司产 品； 脱氧核糖核苷酸末端转移酶 介导的缺 口末 端标记 ( T d T - me d i a t e d d U T P n i c k e n d l a b e l i n g ， T U N E L ) 试剂盒( 德 国 R o c h e 公 司产品) ； 超 氧化物歧化酶 ( s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ， S O D) 测试 盒、 考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒( 南京建成生物工程研 究所产品) ； 人丙二醛( Ma l 0 n d i a l d e h y d e ， MD A) 、 谷胱 甘肽( g l u t a t h i o n e ， G S H) 酶联免疫检测试剂盒 ( 美 国 R & D公司产品) 。 1 1 3 主要仪 器 超净工作 台( 苏州净化设 备有 限公司) ； C O 培养箱( 英国 K e n d r o ) ； 全 自动酶标仪 ( 美国 B i o R A D 6 8 0 ) ； 可见光分光光度计 ( 上海光谱 仪器有限公司) ； 免疫荧光显微镜 ( 日本 N i k o n 8 0 i ) 。 1 2 方 法 1 2 1 细胞复苏、 培养与分组冻存 的 HL E C快速 复苏 ， 接种于 5 m l 含 1 5 胎牛血清的 D ME M 培养 液内 ， 置于 3 7 、 5 C O 培养箱内培养 ， 隔 日换液 ； 待细胞长至融合时开始 1： 3分瓶传代 ， 取对数生长 期细胞进行实验。实验分组如下： 对照组： 正常 H L E C+ D M E M培养液； H 2 O 2 组： 对照组 + H 2 O 2 ； R u预 处理组 ： R u低 剂量组 ( H O 组 +低剂量 R u ) ， R u中剂量组 ( H O ： 组 +中剂量 R u ) ， R u高剂 量组 ( H O 组 +高剂量 R u ) 。具体 的 H 2 O 2和 R u 浓度在实验过程中确定 。 1 2 2 MT T法分析 R u对 H L E C的保护作 用 调 整细胞浓度为 1 x 1 0 m l ， 接种于 9 6孔板 ， 待细胞铺 满孔底弃去培养液 ， 按上述分组 ， R u预处理组分别 用低、 中、 高剂量 R u 处理 1 h ， 再加入 H O 刺激 2 4 h ， 吸出培养液每孔加入 1 5 0 Ix l D M S O溶液， 摇床上 低速振荡 1 0 m i n ， 于全自动酶标仪4 9 0 n m波长测各 孔吸光度( O D ) 值， 按下列公式计算： 生存抑制率 = 3 8 0 安徽 医科大学学报A c t a U n i v e r s i t a t i s Me d i c i n a l i s A n h u i 2 0 1 3 A p r ； 4 8 ( 4 ) ( 对照组 O D值 一实验组 O D值) 对照组 O D值 1 0 0 ， 生存率 = 1 一 生存抑制率， 实验组即 H ： 0 组 和 R u预处理组。 1 2 3 检测 S O D 、 G S H、 MD A含量取对数生长期 细胞 ， 按 1 2 1项分组 ， R u预处理组分别用低 、 中、 高剂量 R u 处理 1 h ， 再加入 H O 2 刺激 2 4 h ； 收集各 组细胞加入 1 ml P B S反复冻融 3次以破碎细胞 ， 离 心收集上清， 黄嘌呤氧化酶法检测每组 S O D含量 ， 生物素双抗夹心酶联免疫吸附法 ( E L I S A) 检测每组 G S H、 MD A含量。 1 2 4 T U N E L法检测细胞凋亡、 采用 T U N E L试 剂盒。将 6孔板 内置好 的细胞爬片弃去上清， P B S 洗 2遍 ， 1 0 多聚 甲醛 固定 1 5 m i n ， 0 5 T r i t o n X 4 通透 8 m i n ， 以 3 H 2 O 2 3 7封 闭 1 5 m i n ， P B S 漂洗干净 ； 每片加 T U N E L反应混合液 5 0 l ， 放入暗 湿盒内 3 7 温育 1 h ， 阴性对 照只加 5 0 tx l T d T酶， 阳性对照加 1 0 0 l D N a s e 1 ； 每片加标记荧光素抗体 的 HR t ( P O D) 6 0 I x l 3 7 o C转化 3 0 m i n ； D A B显色 ， 苏木精复染 ， 二甲苯透明， 中性树脂封片， 光镜下观 察细胞凋亡形态 ， 以细胞核染成深棕色 、 棕黑色为阳 性细胞 ， 每张爬片选取 4个不重叠的阳性细胞最多 的视野， 高倍镜下 ( 4 0 0 ) 拍照， 计算凋亡指数( A I ) ： A I =T U N E L阳性细胞数 总细胞数 1 0 0 。 。 。 1 3 统计学处理采用 S P S S 1 6 0软件进行统计 学分析。数据以 s 表示 ， 多组间两两比较采用单 因素方差分析( o n e w a y A N O V A) 。 2结果 2 1 H O：和 Ru实验浓 度的选 择 正常 培养 的 H L E C分别加入浓度为 08 0 0 Ix mo l L的 H O 和 0 4 0 0 t x m o l f L的 R u处理 2 4 h后 ， M T T法检测细胞 生存率和抑制率。随着 H O 浓度的增加， 细胞生 存抑制率逐渐增高 ， H： O 浓度在 2 0 0 Ix m o l f L时接 近细胞生存半数抑制率( I C 。 ) ， 因此选择 2 0 0 Ix m o l L H O ： 作为 H O ：组实验浓 度， 见 图 1 。浓 度小于 1 0 0 m o l L的 R u对细胞增殖能力无 明显影响 ， 见 图 2 ； 研究选 择 2 5 、 5 0 、 1 0 0 I x m o l L的 R u分别作为 R u低剂量组、 中剂量组和高剂量组浓度进行实验。 2 2 R u对 H2 0 诱导 的细胞毒性保护作 用 R u 预处理组细胞中， H 0 诱导的细胞毒性作用明显减 弱， 与 H 0 组 比较， 细胞生存率显著提高 ( P 0 0 1 ) ， 见表 1 。 2 3 R u对 HL E C中 S O D、 GS H 和 MD A 含量的 影 响 与对照组 比较 ， H ： 0 ： 组S O D、 G S H 含量 明显 一 料 忙 U 工 皇 图 1 不 同浓度 H2 02对 HL E C生存抑制率的影响 与 0 m o L L H2 O2 组 比较 ： P 0 0 1 1 2 0 2 0 0 0 25 5 0 1 0 0 2 00 40 0 Ru 浓 度( t mo l L ) 图 2 不 同浓度芸香苷对 HL E C增殖能力的影响 与 0 m 0 L L R u组 比较 ： PO O 1 表 1 Ru对 H2 02诱导的 H LE C细胞毒性保护作用( n=6 ， ； ) 与对照组 比较 ： 一 P 0 0 1 ； 与 H 2 0 2组 比较 ： P 0 0 5 ， P 0 O 1 减少( P 0 0 1 ) ， 脂质过氧化产物 MD A含量较对照 组升高 ( P 0 0 5 ) ； 而与 H O 组相 比， R u预处理组 S O D、 G S H含量有所提高， MD A含量较 H O 组降低 ( P 0 0 1 ) ， 见表 2 。 表 2 R u对 H2 02损伤的 HL EC中 S OD、 GS H 和 MD A的影响( n= 4， x s ) 与对照组 比较 ： P 0 0 5 ， 一 P0 0 1 ； 与 H2 0 2组 比较 ： P 0 0 5 ， P0 0 1 ； 与 Ru 低剂量组 比较 ： P 0 0 l 如 如 加 0 v料 磊 u I 3 8 2 安徽 医科 大学学报A c t a U n i v e r s i t a t i s Me d i c i n a l i s A n h u i 2 0 1 3 A p r ； 4 8 ( 4 ) 一 般的组织化学和生物化学测定法。本研究用 2 0 0 p mo l I H 2 0 2 诱 导 H L E C凋亡 ， T U N E L标记 D N A断 裂产生的 3 一 O H末端， 再与底物 P O D结合而显色， 光学显微镜下可观察细胞凋亡形态并定量分析凋亡 细胞。实验 中T U N E L染色发现经 2 0 0 I m o l L H， O ， 处理后的细胞大部 分呈凋亡阳性染色 ， 表现为细胞 脱落 ， 核 固缩 ， 变 圆， 染 色呈深 棕或 棕黑 色 ， A I 达 8 8 9 4 ； 而 3个 R u预处理组 阳性染色细胞数量明 显减少 ， 随着浓度增加呈现一定浓度依赖趋势 。 综上所述 ， 黄酮类天然抗氧化剂 R u可 以减轻 H ： 0 ： 引起 HL E C的氧化损伤 ， 提高其抗氧化能力 ， 降低脂质过氧化水平 ， 同时能够抑制 H ： O 诱 导的 H L E C凋亡， 可为临床预防和延缓 白内障发生提供 药物治疗依据。 参考文献 Z h e u Q，F ri e d m a n D S ， L u H，e t a 1 T h e e p i d e mi o l o g y o f a g e - r e - l a t e d e y e d i s e a s e s i n Ma i n l a n d C h i n a J O p h t h a l mic E p i d e mi o