蛋白质分离和鉴定 德 伟 一.概述 l蛋白质组及蛋白质组学概念的 提出 l蛋白质组学形成的历史 l蛋白质组研究的主要手段 v人类基因组计划的完成3-4万个基因，30亿对碱基（解码生命） v基因组是唯一的，但蛋白表达是变化的（解码生命） v后基因组蛋白质组的研究是21世纪生命科学的主要任务（ Wilkins MR et al 1997) v1994年Williams提出测定有机体的基因组所表达的全部蛋白 v1995年Wilkins正式提出Proteome一词 由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部相应的蛋白 质，而研究蛋白质组功能为蛋白质组学（Proteomics） 1 1、蛋白质组及蛋白质组概念的提出、蛋白质组及蛋白质组概念的提出 基因组 转录组 蛋白组 The study of proteins expressed by genomes Completion of the sequencing of the 1st draft of human genome indicates there are approximately 250,000 proteins in the human genome Only 2-5% of proteins in human genome have been identified Expression proteomics (表达蛋白组学) The study of global changes in protein expression Proteomics Cell-map proteomics （细胞图谱蛋白组学） The systematic study of protein- protein interactions through the isolation of protein complexes 2 2、蛋白质组学形成的历史、蛋白质组学形成的历史 1860 Friedrich Miescher identified acid and basic protein components in cell nuclei which was mistakenly believed to carry the genetic material 1970 Kenrick and Margolis Isoelectric focusing and gradient gel electrophoresis: a two -dimensional technique 1972 Bernstein et al The Protein Data Bank with a collection of ten X-ray crystallographic protein structures 1975 OFarrell The modern form of two -dimensional electrophoresis of proteins by high resolution separation 1995 Wilkins Definition of the proteome 1997 Wilkins et al Publication of the first book on proteomics 1999 Ian Humphery-Smith.The first Chair in Proteomics created at the Universiteit Utrecht, The Netherlands. Occupant 2000 March Publication of the most complete proteome of a whole organism, the bacterium Mycoplasma genitalium 2001 Sequencing of the human genome completed. 2 2、蛋白质组学形成的历史、蛋白质组学形成的历史 蛋白组研究的三个主要步骤： Separation of individual proteins by 2-D polyacrylamide gel electrophoresis (2-D PAGE) Identification by mass spectrometry or N- terminal sequencing of individual proteins recovered from the gel Storage, manipulation, and comparison of the data using bioinformatics 3 3、蛋白质组研究的主要手段、蛋白质组研究的主要手段 v双相电泳技术（two dimensional electrophoresis gel 2D） v“双向”高效柱析法 分子筛柱层析 反向柱层析 v质谱分析 ( MS) 辅助激光解析/离子化(matrix-assisted laser disorption / ionization) 电喷雾离子化（electrospray ionization ESI） v生物信息 二.蛋白质的分离和鉴定 1:蛋白质的分离 一维凝胶电泳 二维凝胶电泳 蛋白芯片 双双 向向 电电 泳泳 技技 术术 u1975年，OFarrell et al 发明了双向电泳技术。 u 能检测到30004000种总蛋白，最大可达到一万种 u一个细胞有50006000种不同蛋白，人体有250种细胞，每 个细胞表达300400种自身特有蛋白 SampleSample PrepPrep 2-D2-D GELSGELS MASS SPEC MALDI-TOF SpotSpot CutterCutter ProteinProtein DigestDigest MALDI MALDI SpottingSpotting SampleSample SWISS-PROT/ TrEMBL ESIESI MS/MSMS/MS ImagingImaging D/BASED/BASE PepSeqPepSeq 蛋白组学研究过程 SWISS PROT/ TrEMBL MicroMass ABI Bruker 样品 样品制备2维电泳纯化和点样质谱测序 数据库分析 成像 Protein extract 1 Label with Cy2 Image gel Image analysis: Overlay images Analysis of difference Image analysis: Data quantitation Mix labeled extracts Protein extract 2 Label with Cy3 Protein extract 3 Label with Cy5 Cy2Cy3Cy5 PH 2-11 MW 10k-150k 银染灵敏度4ng 同位素灵敏度 20ppm CoomassieCoomassie Brilliant Blue matrix-assisted laser desorption/ionization,(介质辅助 的激光解吸/离子化 ) 2) ESI; electrospray ionization (电喷雾离子化 ) 3) 多肽分析 多肽氨基酸分析 串联质谱（Tandem-MS）,第一级质谱得到肽的分子离子,选取目标肽 的离子作为母离子，与惰性气体碰撞，使肽链中的肽键断裂，形成一系 列离子，即N端碎片离子系列（B系列）和C端碎片离子系列（Y系列）， 将这些碎片离子系列综合分析，可得出肽段的氨基酸序列。 “protein ladder sequencing”的方法，通过对Edman降解法的修改， 产生一系列截去N端残基的肽段，用MALDI-MS测得这些肽段的质量，从 而推测N端序列。 局限性，譬如Leu和Ile、Lys和Gln不能区分，有些肽的固有序列不 能用质谱法测定。 Genomic Solutions 完整的蛋白组学研究系统 ProduceProduce 2-D Gels2-D Gels Image Image 2-D Gels2-D Gels Excise SpotExcise Spot From GelFrom Gel ProcessProcess ProteinProtein MS & AnalyzeMS & Analyze Spot on MALDI Spot on MALDI StageStage Analyze 2-D Analyze 2-D GelsGels Gene Company Limited 基 因 有 限 公 司 定量分析定量分析 图3.不同发育时期的大鼠胰腺总蛋白二维电 泳图象。第一维电泳采用固相PH梯度凝胶 胶条（PH4-7，线性），第二维电泳采用均 一的12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝胶。各时期 蛋白上样量均为50g，银染。加框区域内 蛋白点各组间有显著差异。(a:E15.5；b: E18.5；c:P0；d:成年) 不同发育时期大鼠胰腺蛋白质组差异的分析 Spot IDSwissprot IDTheoretical Pi/MWObserved Pi/MWSequence coverage(%)Protein name 1P027735.77/68.385.39/7716Alpha fetoprotein (AFP) 2P027735.77/68.385.46/7627Alpha fetoprotein (AFP) 3P027735.77/68.385.54/7626Alpha fetoprotein (AFP) 4P027735.77/68.385.61/7625Alpha fetoprotein (AFP) 5P027735.77/68.385.69/7431Alpha fetoprotein (AFP) 6P027735.77/68.385.61/7429Alpha fetoprotein (AFP) 7P078825.36/65.325.29/7021sterol esterase 8P078825.36/65.325.35/7033sterol esterase 9P078825.36/65.325.41/7027sterol esterase 10P047854.82/56.954.84/5840Protein disulfide isomerase, pancreatic 11P047854.82/56.954.76/5835Protein disulfide isomerase, pancreatic 12P543165.79/52.385.88/5769Pancreatic lipase related protein 1 precuror 13P027735.77/68.385.75/4440Alpha fetoprotein (AFP) 14P046914.79/505.55/3741tubulin, beta 15P166178.02/44.915.9/4031phosphoglycerate kinase 1 16P052184.78/49.675.38/3755Tubulin beta 5 17P543165.79/52.385.68/4257Pancreatic lipase related protein 1 precursor 18P543165.79/52.385.64/3954Pancreatic lipase related protein 1 precursor 19P543165.79/52.385.84/3963Pancreatic lipase related protein 1 precursor 20P073384.9/28.464.89/2848C