分类号 密级 工23S3S2 华中农 I 匕大学博士学位论文 苎麻遗传转化受体系统建立及根癌农杆菌介导法遗传转化研究 E S T A B L I S H M E N TO FR E G E N E R A T I o NS Y S T E MA N D 彳G 月D B 4 C Z E 月，胁M E D I A T E DT R A N S F o R M A T I o No F R A M I E ( B O E H M E R I A N I V E A ( L ) G A U D ) 博士研究生：汪波 指导教师：彭定祥教授 指导小组：孙东发教授 林兴华教授 靳德明教授 余四斌教授 专业：作物栽培与耕作学研究方向：苎麻基因工程 获得学位名称：农学博士获得学位时间：年月日 华中农业大学植物科学与技术学院 二oo 六年十二月 一 一 篓羹羔耋 是如需保密，解密时间2 0 0 8 年1 2 月2 5 日 是否保密 7 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同_ T - 作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：诊良时间：撕年2 月夕日 学位论文使用授权= f 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学校； 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、 编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式j 文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文作者张) ；王良翩张影J 日 签名魄州锄月7 日 签名魄7 -)， 如 、J t 、 h 一 J 夕， 甚 廖 摘要”I A B S T R A C T ”III 缩写词表”V I 第一章文献综述l 1 1 植物转堪l 大| 概述l 1 2 根癌农杆菌介导的植物遗传转化研究进展2 1 2 1 根癌农杆菌的乍物学特性2 1 2 2 根癌农杆菌T i 质粒的结构和功能3 1 2 3 根癌农杆菌T i 质粒的转化机理4 1 2 4 根癌农杆菌介导的遗传转化体系的建立4 1 2 4 1 转化载体的构建一5 1 2 4 2 受体系统的建立6 1 2 4 3 目的基因的转化6 1 2 5 影响转化效率的主要因素8 1 2 5 1 农杆菌菌株8 1 2 5 2 基因活化的诱导物8 1 2 5 3 外植体的类型和生理状态“9 1 2 5 4 外植体的预培养9 1 2 5 5 外植体的接种及共培养一9 1 2 5 6 转化细胞的选择培养1 0 1 2 6 转基因植物的证据1 0 1 3 苎麻组织培养及遗传转化研究进展1 1 1 3 1 苎麻组织培养研究进展1 1 1 3 1 1 茎尖( 腋芽) 快速繁殖1 1 1 3 1 2 苎麻器官发生研究1 2 1 3 1 3 苎麻体细胞胚胎发生研究l7 1 3 1 4 苎麻原生质体培养研究1 7 1 3 1 5 苎麻花药培养研究18 1 3 1 6 苎麻体细胞无性系变异研究1 8 1 3 2 苎麻遗传转化研究进展18 1 4 苎麻分子标记、功能基因等研究进展1 9 1 4 1 苎麻分子标记研究进展1 9 1 4 1 1R A P D 技术在苎麻上的应用。1 9 1 4 1 2 微卫星标记技术在苎麻亲缘关系上的应用2 0 1 4 2 苎麻功能基因研究进展。2 0 1 5 苎麻组织培养、遗传转化研究等存在的问题2 0 1 5 1 苎麻组钐 培养研究存在的问题2 0 1 5 2 蔓麻遗f t 转化研究存在的问题2 2 1 5 3 苎麻分f 标记、功能基因研究存在的问题2 3 1 6 本研究的目的和意义2 3 1 6 1 苎麻遗传转化高效受体系统的建立2 3 1 6 2 苎麻体细胞无性系变异的研究2 3 1 6 3 根癌农杆菌介导苎麻遗传转化体系的建立2 3 1 6 4 转绿色荧光蛋白基因( G F P ) 、异戊烯基转移酶基因( i p t ) 、 苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因( B t ) 苎麻再生植株的获得2 4 1 6 4 1 转G F P 基因植株的获得2 4 、 1 6 4 2 转i p t 基因植株的获得2 4 1 6 4 3 转B t 抗虫基因植株的获得2 4 第二章苎麻遗传转化受体系统的建立2 5 2 1 种子实生苗各外植体再生体系的建立2 5 2 1 1 材料和方法2 5 2 1 1 1 材料2 5 2 1 1 2 无菌苗的培育和外植体的准备一2 6 2 1 1 3 子叶外植体再生体系的建立“2 6 2 1 1 4 不同冈素对再生影响的研究一2 6 2 1 1 5 再生苗的伸长生长、生根和移栽一2 7 2 1 1 6 培养基的配制和培养的条件一2 7 2 1 1 7 重复设计和数据分析2 7 2 1 2 结果与分析2 8 2 1 2 1 子叶再生体系一2 8 2 1 2 2 影响苎麻外植体再生的因素3 0 2 1 2 3 不同浓度N A A 对再生苗生根的影响3 9 n 7 中 坌v t j 2 1 2 4 再生前的伸长，卜长、生根以及移栽“4 0 2 2 试管苗各外植体再生体系的建立4 2 2 2 1 材料和方法4 2 2 2 1 1 材料- 4 2 2 2 1 2 无菌试管苗及外植体的准备4 2 2 2 - 1 3 小M 外f f i 体的再生一4 2 2 2 1 4 再生菌的伸长生长、乍根和移栽一4 2 2 2 1 5 培养罐的配制和培养条件“4 2 2 2 1 6 重复设计和数据分析“4 3 2 2 2 结果与分析4 3 2 2 2 1 试管苗各外植体的再生4 3 2 2 2 2 苗龄对再生的影响4 3 2 2 2 3 基因型对再生的影响一4 3 2 3 苎麻体细胞尢性系变异的研究4 6 2 3 1 材料和方法4 6 2 3 1 1 材料4 6 2 3 1 2 再生笛的倍性检测4 6 2 3 1 3 试管苗不同外植体再生苗的R A P D 分析4 6 2 3 2 结果与分析4 7 2 3 2 1 流式细胞仪检测再生植株的倍性4 7 2 3 2 2 再生植株的R A P D 分析4 7 2 4 讨 仑4 8 2 4 1 高效遗传转化受体系统的建立4 8 2 4 2 关于苎麻外植体的再生方式4 9 2 4 3 关于影响再，E 的因素5 0 2 4 3 1 基因型5 0 2 4 3 2 外植体类型5 0 2 4 3 3 外植体供体的苗龄5 l 2 4 3 4 基本培养基5 l 2 4 3 5 激素类型和浓度5 l 2 4 3 6 培养条件5 2 ，o 2 4 4T D Z 在苎麻组织培养研究上的应用前景5 2 2 4 5R A P D 技术在苎麻体细胞无性系变异研究中的可行性5 3 2 4 6 本研究有待改进之处5 3 第三章苎麻直接体细