蛋白质印迹分析 Western blotting 实 验 一 医学生物化学与分子生物学实验教程 P.216 实验时间安排实验时间安排 第一天第二天第三天 1.SDS-PAGE胶制 备； 2.样品制备和样品 蛋白质含量测定； 3.电泳； 1.转移电泳 2.考马斯亮蓝染色 3.膜封闭 4.加1抗过夜温浴 1.洗膜、考马斯亮 蓝染色胶脱色 2.加酶标2抗温浴 3.洗膜与显示 4.结果分析 Western blotting 蛋白质印迹一般由凝胶电泳、样品的印迹和 免疫学检测三个部分组成。 第一步是做 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测 样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。 第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一 种固相支持物上， 常用NC 膜和 PVDF 膜。 第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜 上的所要研究的相应抗原。 实实 验验 原原 理理 第一部分：SDS-PAGE电泳 1、蛋白中含有很多的氨基（+）和羧基（-），不同蛋白将 带不同量的电荷；为使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有 关，上样前应进行处理，即在样品中加入含有SDS 和-巯基 乙醇的上样缓冲液。经高温处理，使SDS 与蛋白质充分结合 ，蛋白质完全变性和解聚，形成棒状结构，同时使整个蛋白 带上负电荷，电泳时凝胶中所含的SDS负电荷多肽复合物向 正极推进。 -巯基乙醇为还原剂，破坏二硫键。 2. 蛋白样品处于 pH6.8 压缩胶的上层，pH8.8 的分 离胶层在下层。由于pH不连续和胶孔径大小不连 续，在浓缩胶运动中，Pro-受阻小，不同的蛋白 质可被浓缩到分离胶的上成层，使全部蛋白质处 于同一起跑线上；当蛋白质进入分离胶时 ，不同不同 蛋白因蛋白因分子筛效应分子筛效应和和电荷效应电荷效应而出现迁移率的差而出现迁移率的差 异，异， 最终达到彼此分开最终达到彼此分开 。 SDS聚丙烯酰胺凝胶的分离范围 丙烯酰烯酰 胺浓浓度（） 线线性分离范围围（KD） 151043 121260 102080 7.53694 5.057212 第二部分：样品的印迹 1. 选择适当的膜并进行预处理： NC膜的预处理： 剪裁与胶大小一致的NC膜，将其浸入1转移缓 冲液平衡5 分钟以上 PVDF 膜的预处理： 剪裁与胶大小一致的膜泡入甲醇中，约 1-2 分钟 。 转膜转膜 膜的选择膜的选择 尼龙膜尼龙膜 硝酸纤硝酸纤 维素膜维素膜 封闭非特异性抗体结合麻烦封闭非特异性抗体结合麻烦 简单快速封闭非特异性抗体结合简单快速封闭非特异性抗体结合 价格昂贵价格昂贵 价格便宜价格便宜 特殊要求下的选择特殊要求下的选择 需要更高的蛋白结合率需要更高的蛋白结合率 （尼龙膜：（尼龙膜： 480g/cm480g/cm 2 2 ；硝酸纤维素膜：；硝酸纤维素膜：80g/cm80g/cm 2 2 ） 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱 需要更大的机械强度需要更大的机械强度 目的蛋白分子大小(kDa) 胶浓浓度 转转移时间时间 （h） 80-1408%1.5-2.0 25-8010%1.5 15-4012%0.75 2015%0.5 2. 电流 1mA-2mA/cm2，通常 200mA/膜，按照 目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间。 第三部分：特异抗体与抗原结合、显色 样品转移到硝酸纤维素膜的过程称为印迹（blot） 。膜封闭后，用针对目的蛋白的特异抗血清（一抗 ）处理，印迹中只有待研究的目的蛋白质与一抗结 合，而其它蛋白质不与一抗结合。 清洗后，再用适当标记的二抗处理（二抗是指抗一 抗的抗体），与适当底物溶液反应后即可产生可见 区带，指示目的蛋白的位置。 提取组织或细胞蛋白，测得含量 制备SDS-PAGE胶 蛋白样品变性、电泳 电泳转膜 封闭，一抗过夜 清洗，二抗结合 清洗，底物显色，曝光、显影， 结果分析 基 本 操 作 流 程 实 验 操 作 一、小鼠血清制备 （Preparation of Mouse Serum）（已准备好） 1. 取小鼠一只，断颈收集血液于一只1.5ml离心管中，置37 温浴15-45min；其间，用剪刀开腹取出肝脏100mg左右，或 者剪取鼠尾巴约1cm长，置-20 保存（实验四使用） 2.盐析制备球蛋白：向小鼠血清中加入等体积饱和硫酸铵溶液 ，充分混匀后室温放置5min，10000转/min离心，5min，弃 上清，加入与血清等体积0.15 mol/L NaCl。溶解后即得小鼠 IgG样品。 3.对照兔血清样品同法制备。 二、二、SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 1. 胶模准备与灌胶： 配分离胶（10ml）：取一个 烧杯，加入以下成分: 分离胶缓冲液 2.5ml 40%丙烯酰胺胶液 2.5ml H2O 4.9ml 10%过硫酸铵 0.1ml 充分混匀后，再加入5l TEMED，立即摇匀，灌入胶模，至 距胶顶约1.5cm；徐徐加入0.5-1ml水覆盖胶顶。室温放置待胶 凝聚（约需30分钟），其间配压缩胶。 配压缩胶（4ml）：取一个烧杯，加入以下成分: 压缩胶缓冲液 1.0ml 40%丙烯酰胺胶液 0.5ml H2O 2.5ml 10%过硫酸铵 40l 混匀；待分离胶与上面的水层之间的界限由清晰逐渐消失 ，又重新出现后，倾去上层水，用滤纸吸干；向压缩胶混 合液中加入4l TEMED，立即摇匀，灌入胶模至距胶顶约 0.5cm；徐徐插入上样梳，勿留仍何气泡于胶液中；放置1 小时以上。 2. Bradford法蛋白质含量测定： 取8只试管，按以下顺序加入各种试剂： 管号: 1 2 3 4 5 鼠IgG 兔IgG 空白 标准蛋白 L 样品 l 0.15M NaCl L 1020304050 11 290280270260250299299300 向每只管中各加入显色试剂 3 mL ，立即混匀，放置 10min后，于分光光度计上，595 nm比色测定OD值；以 OD值为纵坐标，标准蛋白质浓度为横坐标，作图求出血 清中蛋白质的浓度。 3. 样品准备： 分别取含适量的小鼠血清的及兔血清（阴性对照 ）置入1.5 ml离心管中，根据样品体积，分别加2 SDS电泳上样液至250L，混匀；置95 加热10 min。 样品（250L） 5g/L 2 SDS （125L） 血清 （XL） = 5g/L 250L血清蛋白浓度 0.9%NaCl （125-XL） 4. 装配： 胶凝后，去除夹子和垫条；将电泳仪的下槽 中注满电极液，将胶模的有耳短玻板面向电 泳仪的支架，插入电泳仪下槽；用大夹子将 胶模上部与支架夹紧；向电泳仪上槽中加入 电极液，至没过短玻板上缘1cm；观察上槽 液有无泄漏。无泄漏时，用记号笔标记上样 井位置，拔除上样梳，整理上样井。 5. 上样： 向上样井中顺序加入相当量的样品，鼠IgG 100g、10g； 兔IgG 100g、10g；蛋白分子量标准物10l；鼠血清100g 、10g；兔IgG 100g、10g；预染色的蛋白分子量标准物 10l。一份用于蛋白印迹分析，一份用于染色分析。 鼠 100g 鼠 10g 兔 100g 兔 10g M (预染 ） 鼠 100g 鼠 10g 兔 100g 兔 10g M (未预染） 印迹分析染色分析 6. 电泳： 将电泳电源与电泳仪用导线相连，负极 接上槽，正极接下槽；加电压（25V/大 胶； 10V/小胶）过夜电泳。 三、转移电泳 Transfer Electrophoresis 盛有电转移缓冲液的塑料盘中，按顺序浸入垫网，二张滤纸(与 垫网同大)，剪一与分离胶同大的硝酸纤维素膜，先让其漂在液 面上，待液体浸透膜，无任何白斑后，让液体没过膜，再浸入 二层滤纸和一层垫网。 1. 电转移准备： 2. 转移夹装配： 向转移电泳仪中注入转移电泳缓冲液至三分之一高度； 盛有转移电泳缓冲液的塑料盘中，将转移夹板打开，夹板的 一扇板平置入塑料盘中，另一扇板直立；然后按顺序逐层移 入一层垫网和两层滤纸，层间不可留有气泡； 电泳完毕，取下电泳胶模，将有耳玻板面向下平置桌面上， 向下端两玻板间插入刀片将玻板分开；用刀片切去压缩胶 ，再将分离胶从中分为两半，一半用于电转移一半用于考马 斯亮蓝染色（参见附1）；将胶平放在滤纸的中央，其与滤 纸之间不可留气泡；再顺序逐层覆盖上硝酸纤维素膜，二层 滤纸和垫网；扣上转移夹，将其夹扣位于上方插入转移电泳 槽中，注意令硝酸纤维素膜所在一侧对向红色接线柱，绝不 可颠倒。 NC膜 滤纸 滤纸 SDS-PAGE 滤纸滤纸 SDS-PAGE NC膜 3. 转移电泳： 向转移电泳仪中注入转移电泳缓冲液，液面必须没过硝酸纤 维素膜顶端；转移电泳仪中放入一磁搅棒，合上盖子，将转 移电泳仪置于一磁力搅拌器上；用导线将转移电泳电源与转 移电泳仪连接，正极接红色接线柱，负极接黑色接线柱；开 启磁力搅拌器；调转动速度，以磁力搅拌子转动不会被甩开 ，而速度又最大为度；设输出电压为50伏，通电电泳2小时 ，最好在4进行。 四、酶标免疫反应显示 Immuno-detection of Protein Blots with HRP- labeled Antibody 1. 蛋白转移膜的丽春红染色显示（本次实验不做此步） 转移电泳完毕，断电，取出转移夹，取出转印膜于20ml蒸馏 水中漂洗一遍，然后用10ml丽春红染液（0.2%丽春红-1%乙 酸）染1min；用蒸馏水漂洗至背景近白色，漂洗应少量多次 ，每次30ml左右；照相留底；继续用蒸馏水漂洗至色带消失 或者基本消失。 2. 免疫反应： 将硝酸纤维素膜，在含蛋白质面用圆珠笔作方位标记和蛋白 质分子量标准物位置标记；然后浸入漂洗缓冲液中漂洗2分 钟, 去除漂洗液；加入封闭液，以液体展开后刚刚没过膜表 面为宜，37保温振摇30-60分钟；加入适量一抗 (既每毫升 封闭液中加入1-5微升抗体），4 振摇过夜； 去除含一抗的封闭液，用漂洗液漂洗硝酸纤维素膜3遍，每 遍加20ml漂洗液振摇5分钟，再加入含抗一抗的辣根过氧化 物酶酶标二抗的封闭液，37振摇保温1-2小时。 2. 封闭 n 加入封闭液（5%脱脂奶粉TBST溶液或 3%BSA TBST溶液），以液体展开后刚刚没 过膜表面为宜，室温下置摇床1h； 3. 加入适量一抗（根据抗体说明书确定相应用 量），4 摇床过夜； 4. 取出膜条，TBST彻底清洗一抗，加入酶标 二抗，37 保温1h。 Whats happen? 目的蛋白（抗原 ） 一抗 带酶标的二抗 3. 显色检测： 根据酶标所用酶选用适当的显示方法。本实验采用辣根过 氧化物酶标记抗体，相应地采用氯萘酚成色显示方法。倾 去含酶标抗体的封闭液，用TBS漂洗硝酸纤维素膜3遍，各 振摇5分钟；蒸馏水漂洗1遍，漓去水后在显色液中显色， 轻轻振摇至显色深度不再增加，然后放入水中漂洗停止显 色，照相存底，移到滤纸上干燥保存。 Summary 附1：蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳的考马斯亮蓝染色显示方法 1. 固定漂洗（Fixing）： 待蛋白电泳进行到溴酚蓝带迁移至距离胶底0.5-1cm 处，关闭 电源，倾去电极液，卸下胶模，取下胶块浸泡于5倍体积固定 液中（ 只要分离胶）；放置于摇床上振摇30-60分钟。 2. 染色（Staining）： 弃固定液，加入5倍体积的染色液，于摇床上振摇2-16小时。 3. 脱色（Destaining）： 倾去染色液，加入5体积脱色液，于摇床上振摇至背景脱净 ，照相保存结果。 4. 干胶保存（Gel Drying）： 取玻璃板，裁取两