l8河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，Fh本人独0：完成位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。儿发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应的法律责任。研究生签名：葛小砷导师签章：二害崆磊霉毒娄霉：秽、莎叽u年一月7日i一河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究牛签名：葛，】、历1目录中文摘要l英文摘要7英文缩写15研究论文血管外膜源一氧化氮对AngII诱导的血管内皮细胞凋亡的影响及通络药物的干预作用引言l6第一部分“营卫承制调平”指导心脑血管病防治研究的理论探讨一”“19参考文献25第二部分血管外膜源一氧化氮对AngII诱导的血管内皮细胞凋亡的影响前言”“一“一”“一“一“一”217刖舌”“”一“一”“一“”“一”“。实验一AngII对内皮细胞活力的影响材料与方法，27结果-30附图、附表31实验二AngII对外膜源NO的影响材料与方法33结果“36附图、附表37实验三血管外膜源一氧化氮对AngII诱导的血管内皮细胞凋亡的影响材料与方法39结果”“一”一”一一”“一一“一”“一”一”一”一“42附图、附表44讨论49参考文献52第三部分通络药物对AngII诱导的外膜源一氧化氮的影响前言一一一55刖吾”一”“一”“一“一一”“一”一”“一“”一”“一”一”。)材料与方法55结果BOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOIQOOOO58附图、附表60讨论66参考文献68结论一70综述一浅述营卫7l综述二血管外膜在血管病变中作用的研究进展77致谢-84个人简历85中文摘要血管外膜源一氧化氮对AngII诱导的血管内皮细胞凋亡的影响及通络药物的干预作用摘要目的：本实验以“营卫承制调平理论为指导，结合西医学近年研究揭示的血管外膜在血管病变中发挥的重要作用，从“营气与内膜、“卫气”与外膜相关性为切入点，通过建立内外膜共孵育细胞模型，探讨内、外膜相互影响及通络药物干预血管病变中显示的承、制、调、平规律，既是对中医营卫学说的传承，又对更全面深刻的揭示血管病变发展演变的内在机制具有指导意义。方法：l血管外膜源一氧化氮对AngII诱导的血管内皮细胞凋亡的影响11AngII对体外培养的血管内皮细胞活力的影响常规培养人脐静脉内皮细胞ECV-304，选择处于对数生长期融合良好的内皮细胞，经胰蛋白酶消化后调整细胞密度为l105个mL，接种于96孔板，待细胞融合致80后，细胞随机分为：(1)对照组：加入无血清DMEM培养基；(2)AngII组：加入终浓度分别为10一molL、10一molL、10molL、10击molL、10巧molL的AngII。各组分别继续培养Oh、6h、12h、24h、48h后，利用SRB法检测各组细胞活力的变化。12AngII对血管外膜源NO释放的影响选取清洁级健康雄性SD大鼠，仔细分离并截取胸主动脉，剥离外膜，并剪成2mmx2mm的组织薄片，吸干称重，用含10FBS的DMEM培养基培养，24h后更换为无血清DMEM培养基继续培养24h，再加入终浓度为10击molL的AngII继续培养1h、2h、12h、24h、48h，同时设立空白对照组。硝酸还原酶法检测各组培养上清液中NO含量，免疫印迹法检测各组外膜iNoS蛋白表达水平。13外膜源NO对AngII诱导的ECV304凋亡的影响。实验分为5组：(1)单纯内皮细胞组：孵育的ECV-304细胞，常规培养；(2)内皮细胞+外膜组：内皮细胞和外膜组织共孵育；(3)内皮细胞+AngII组：孵育的内皮细胞中加入AngII(终浓度为10击molL)共孵中文摘要育；(4)内皮细胞+外膜+AngII组：于孵育的外膜中加入AngII(终浓度为10。6molL)，2h后把外膜和上清一并加入到内皮细胞中继续孵育24h；(5)内皮细胞+LNNA+#b膜+AngII组：外膜与NOS阻断剂LNNA(10巧molL)预孵育30min，PBS液洗涤3次，然后加入终浓度为106molL的AngII预孵育，最后与内皮细胞继续孵育。实验结束后，HE染色观察血管内皮细胞形态学变化，SRB法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡率，硝酸还原酶法间接检测上清一氧化氮水平，westernblot法检测各组细胞中eNOS蛋白表达水平2通络药物对AngII诱导的外膜源一氧化氮的影响21通心络对血管外膜源NO释放的影响血管外膜的制备和培养同第一部分，然后分别加入终浓度为0ugml、25ugml、50ugml、100ugml、200ugml、500ugml的通心络继续培养Oh、1h、2h、4h、6h、8h。实验结束后收集上清，离心后检测各组NO水平。22营卫调节方对血管外膜源NO释放的影响血管外膜的制备和培养同第一部分，然后分别加入终浓度为O、O01、005、01、05、1的营卫调节方继续培养oh、lh、2h、4h、6h、8h。实验结束后收集上清，离心后检测各组NO水平。23通络药物对AngII诱导的外膜源一氧化氮的影响外膜制备和培养同第一部分，然后分为8组：(1)单纯外膜组：正常完全培养基与外膜共孵育；(2)外膜+AngII：孵育的外膜中加入AngII(终浓度为106molL)共孵育；(3)外膜+通心络：孵育的外膜组织中加入通心络(终浓度为50ugm1)共孵育24h；(4)外膜+AngII+通心络：AngII与外膜预孵育，2h后加入通心络继续孵育24h；(5)外膜+L-NNA+AngII+通心络：外膜与NOS阻断剂L小NA(10巧molL)预孵育30min，PBS液洗涤3次，然后加入终浓度为106molL的AngII预孵育，2h后加入通心络继续孵育24h；(6)外膜+营卫调节方：孵育的外膜组织中加入营卫调节方(终浓度为O05)共孵育；(7)外膜+AngII+营卫调节方：AngII与外膜预孵育，2h后加入营卫调节方继续孵育24h；(8)外膜十L小NA+AngII+营卫调节方组：外膜与NOS阻断剂LNNA(10巧molL)预孵育30min，PBS液洗涤3次，然后加入终浓度为10-6molL的AngII预孵育，2h后加入营卫调节方继续孵育24h。实验结束后硝酸还原酶法间中文摘要接检测上清一氧化氮(No)，westernblot法检测各组中iNOS蛋白表达。结果：。1血管外膜源一氧化氮对AngII诱导的血管内皮细胞凋亡的影响11AngII对ECV304细胞活力的影响AngII可明显降低ECV304的活力，且有量效关系，与正常对照组相比，各浓度的AngII均能明显引起ECV304凋亡，10。9molL的AngIIOD值与正常组比较降低比较明显伙o05)，10一、10、10石、10巧molL的AngIIOD值降低更明显(氏001)I与10。9molL的AngII相比，10曲molL的AngIIOD值降低最为显著俨32928272625242345groupFig2TheinfluenceofvascularadventitiaderivednitricoxidetoAngIIinducedendothelialcellviability：comparedwith1group，料PO01；comparedwith39roup：槲P001；comparedwith49roup：$尸o051：Neipixibaogroup；2：Neipixibao+waimo；3：Neipixibao+AngII；4：Neipixibao+waimo+AngII；5：Neipixibao+Lwaimo+AngII2345groupFig3TheinfluenceofvascularadventitiaderivednitricoxidetoAngIIinducedcellapoptosisrate：comparedwithlgroup，宰P005；comparedwith39roup，恹O05；comparedwith4group，$尸O051：Neipixibaogroup；2：Neipixibao+waimo；3：Neipixibao+AngII；4：Neipixibao+waimo+AngII；5：Neipixibao+Lwaimo+AngII45培：2H比如8642Oop裔一op鱼706050凸30o20lOOl2gIup45竺三T竺NOeonten拿change。fendothelialcellindifferentgroups：c(mp批dW“h19roup氏o05；c。mparedwith39roup，坼)ot01；三m二redwith49roup，Sp005势一懒铟懒黔懒徽，净eNOSl2345Bactin塔舭埘叫姬A弘+啪砒文哪啪耕埘m：奎脚耻炙西Nk玉鸥；A巾+墓呦啪：星缈pbd妯N啦hS研喀m坝A1言眦喀删她研一A行阻+|耄蛳叶砌姗aD斗Hn旧竺涨蚵灿d十加钮缈铒蓍砉脚篇b办昭施办鹕朗；A0MDCKm蠹呦淝默一姗铂p