中国医科大学 硕士学位论文 色氨酸羟化酶基因T3792A位点遗传多态性与抑郁症的相关性及 法医学意义 姓名：王兵 申请学位级别：硕士 专业：法医学 指导教师：王保捷 20080401 英文缩略语 8 术 中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同 工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：墨日期：型 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究 生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保 证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科 大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学 校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密 内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 王兵 丽移r 日期：塑壁! 兰 中文论著摘要 色氨酸羟化酶基因T 3 7 9 2 A 位点遗传多态性与抑郁症的 关联性及法医学意义 刖舌 5 一羟色胺( 5 - h y d r o x y t r y p t a m i n e ，5 - H T ) 是人体新陈代谢过程中的一个重要 物质，它广泛分布于体内各组织。作为中枢神经递质，参与多种神经活动。5 一H T 在血液中的浓度，还有它的生理代谢过程以及在代谢过程中所涉及的酶类、受体、 载体等因素都会影响5 一H T 在中枢神经系统的正常表达。 色氨酸羟化酶( t r y p t o p h a nh y d r o x y l a s e ，T P H ) 是5 一H T 合成过程中的限速酶， 它主要分布于大脑和肠嗜铬细胞。T P H 的生理活性和表达水平的正常与否影响着 5 - H T 的血浓度，通过增强或减弱5 - T H 及其代谢物的作用强度，进而影响它在中枢 神经系统的功能。5 一H T 的合成和代谢途径如下：色氨酸一5 一羟色胺酸一5 一H T 一5 一 羟色醛一5 一羟吲哚乙酸( A 从D ) 。 T P H 基因位于染色体l l p l 5 3 - p 1 4 ，在标记物0 1 1 S 1 5 1 $ I D l l S l 3 4 之间，全长 2 9 k b p ，有1 3 个外显子，包括外显子1 ( 1 A ，1 B ，1 C ) ，2 - 1 1 ，共编码4 4 4 个氨基酸。 T P H 基因存在多个变异点且具有遗传多态性，这些多态性位点分别位于上游启 动区，内含子1 B 区、1 C 区、内含子7 、内含子8 及内含子9 区，而且在下游3 区亦 有一微卫星重复序列。 本研究选择T P H 基因T 3 7 9 2 A 位点，调查其在中国北方汉族群体、藏族群体及 抑郁症患者群体中的遗传多态性，并探讨T P H 基因T 3 7 9 2 A 位点的遗传多态性与抑 郁症的关联性及其法医学意义。 材料和方法 根据目标序列设计引物，应用A S P C R 技术扩增T P H 基因T 3 7 9 2 A ，以聚丙烯酰胺 凝胶电泳分离结合银染显带的方法，对3 0 2 例中国北方汉族个体、1 3 5 例中国藏族 个体及1 1 3 例抑郁症患者进行了基因分型。 结果 3 0 2 例中国北方汉族个体血液样品，通过常规电泳法检测其基因型，检出A A 型7 8 例，A T 型1 6 9 例，T T 型5 5 例。计算得出等位基因A 频率为0 5 3 8 ，等位基因T 频 率为0 4 6 2 。1 1 3 例抑郁症患者血液样品经过检测，检出从型4 4 例，A T 型5 2 例，T T 型1 7 例。计算得出等位基因A 频率为0 6 1 9 ，等位基因T 频率为0 3 8 1 。1 3 5 例中国藏 族个体血液样品，经过检测检出从型2 2 例，A T 型6 9 例，T T 型4 4 例。计算得出等位 基因A 频率为0 4 1 9 ，等位基因T 频率为0 5 8 1 。 讨论 通过对3 0 2 例中国北方汉族个体、1 3 5 例中国藏族个体T P H 基因T 3 7 9 2 A 位点 遗传多态性分析，所得数据基因型分布符合H a r d y W e i n b e r g 平衡定律。根据对 T P H 基因T 3 7 9 2 A 位点在中国北方汉族群体、中国藏族群体中的等位基因频率和基 因型频率分别计算得出：T P H 基因T 3 7 9 2 A 位点在中国北方汉族群体的D P 值为 0 5 8 7 ，H 值为0 4 9 7 ，E P P 值为0 1 8 7 。在中国藏族群体中的D P 值为0 6 0 6 ，H 值 为0 4 8 7 ，E P P 值为0 1 8 4 。表明该位点在两个群体中属于高鉴别能力的遗传标记 系统，适合法医学的应用。 本实验的研究结果表明，T P H 基因T 3 7 9 2 A 位点在抑郁症患者群体和健康对照 群体中，基因型频率分布组间比较存在显著性差异，具有统计学意义( X 2 - 4 4 2 2 ，P = O 0 3 5 ) 。同时，在抑郁症患者群体中等位基因A 的频率明显高于健康 对照群体的频率。抑郁症患者群体中的从基因型频率也高于健康对照群体的频 率。因此推测T P H 基因T 3 7 9 2 A 位点等位基因A 与抑郁症之间有一定的关联性，可 能是抑郁症的易感等位基因。 将本文获得的数据与文献中报道的法国白种人群体的等位基因频率 ( A = 0 6 6 0 ，T = O 3 4 0 ) 进行比较，汉族与藏族、汉族与法国白人及藏族与法国白人 2 之间均表现为显著性差异( P O 0 5 ；藏族X2 = 0 0 8 3 ，P O 0 5 ；抑郁症X 2 = O 0 6 5 ，P = 0 0 5 ) ，均符合H a r d y W e i n b e r g 平衡。在中国北方汉族群体中，D P 值 为0 5 8 7 ，H 值为0 4 9 7 ，E P P 值为0 1 8 7 。在藏族群体中，D P 值为0 6 0 6 ，H 值为0 4 8 7 ， E P P 值为0 1 8 4 。 表1 ，T P H 基因T 3 7 9 2 A 位点在中国北方汉族群体和藏族群体中的多态性分布 X2 = i 0 6 6 9 ，P O 0 5 ，符合H a r d y W e i n b e r g 平 衡。T P H 基因T 3 7 9 2 A 位点在抑郁症患者中等位基因A 的频率为0 6 1 9 ，明显高于健 康对照群体的0 5 3 8 。同时，抑郁症患者的A A 基因型频率0 3 8 9 高于健康对照群 体0 2 5 8 ，基因型频率分布组间比较存在显著性差异( X2 = 4 4 2 2 ，P = O 0 3 5 ) 。 表2 ，T P H 基因T 3 7 9 2 A 位点在对照组和抑郁症患者组的多态性分布 讨论 一、单核苷酸多态性检测的意义 T P H 基因T 3 7 9 2 A 位点的多态性为S N P ( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ， 单核苷酸多态性) ，属于“第三代D N A 遗传标记”，其特点是指在基因组上单个核 苷酸的变异，包括单核苷酸的置换( 转换与颠换) 、缺失和插入。转换和颠换多见， 二者之比为2 ：1 。S N P 在C G 序列上出现最为频繁，而且多是C 转换为T ，原因是 C G 中的C 常为甲基化的、自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。人体许多表型差异、对 药物或疾病的易感性等等都可能与S N P 有关。各种疾病，包括肿瘤相关的基因组 突变被发现。现在普遍认为S N P 研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤。这 主要是因为S N P 将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因 的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。从实验操作来看，通过S N P 发现疾病相关基因突变要比通过家系来得容易；有些S N P 并不直接导致疾病基因 的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记。因此，本研究选择 了属于单核苷酸多态性的T P H 基因T 3 7 9 2 A 位点作为研究指标，观察并探讨其多态 性与抑郁症的关系。 一般而言，S N P 是指变异频率大于1 的单核苷酸变异。在人类基因组中大概 每1 0 0 0 个碱基就有一个S N P ，人类基因组上的S N P 总量大概是3 1 0 6 个。为法 医学个人识别与亲权鉴定提供了丰富的候选遗传标记。因此，其多态性分布在不 同群体中的数据的调查是法医学研究工作的重要内容之一。 由于S N P 的结构特点，能够提供被检测的片段可能很短，其检测技术的开发 在严重降解与微量检材的遗传标记检测中也将具有重要意义。 二、A S P C R 分型方法的建立 等位基因特异性P C R ( a l l e l e s p e c i f i cP C R ，A S P C R ) 是一项在P C R 基础上 发展起来的新方法，通过P C R 和凝胶电泳即可检测出D N A 中各种点突变。A S P C R 的基本构思是设计2 个A S O 引物，使之与另一引物构成P C R 反应体系。这2 个引 物与探针的A S O 不同，等位基因特异性碱基不是位于A S O 中间，而是置于引物的 3 端。这种设计是基于耐热T a qD N A 聚合酶缺乏3 一5 外切校正活性的特点。 1 6 引物3 端的特异碱基分别互补于野生型和突变型等位基因的相对碱基，若此碱 基对形成错配，链延伸反应就会因3 ，5 一磷酸二酯键形成障碍而受阻，故此法又称 扩增受阻突变体系( a m p l i f i c a t i o nr e f r a c t o r ym u t a t i o ns y s t e m ，A R M S ) 。其 扩增结果为：“野生”模板阻碍，“突变”引物放大；或“突变”模板阻碍，“野生“ 引物放大。本实验在文献报道的基础上，确定应用A S P C R 技术检测T P H 基因T 3 7 9 2 A 位点。首先根据突变位点T - A ，自行设计两对分别检测不同等位基因的特异性引 物，要求两对引物的P C R 反应条件尽量接近，可以在同一反应体系中进行P C R 扩 增。P C R 产物可以出现3 条谱带，其中1 条公共谱带可作为实验的内标，作为实 验的成功的标志物。 A S P C R 点突变的检出率依赖于反应条件的优化和防止引物与靶D N A 错配时可 能发生的错配延伸，本研究通过调整实验条件，包括引物浓度、模版D N A 量、T a q 酶的浓度及反应的温度与时间等，建立了标准的实验程序与条件，保证了实验结 果的准确性。 三、T P H 基因T 3 7 9 2 A 位点的遗传多态性与抑郁症的关联 5 - H T 作为一种神经递质参与多种中枢神经活动，如情绪控制、调节睡眠、焦 虑、酗酒、摄食、性行为等1 。5 一羟色胺能系统的紊乱已经影响到人类神经精神 状态，包括抑郁症、两极神经细胞的紊乱、精神分裂症、自闭症、注意力不集中 或多动症、自杀行为口 1 0 J 。 已有文献报道，对不同种族的大量研究提示，5 一羟色胺系统的功能障碍与抑 郁症关联密切，许多抗抑郁药提高5 - H T 浓度，从而改善抑郁症。在家系、双生子 及寄养子的研究中已经发现了5 - H T 系统中的一些危险基因的证据，