山东大学实验报告 2013年 9 月19日至10月3日姓名 系年级 2011级生物技术 组别四 科目分子实验 学号 同组者 题目 pUC19质粒DNA的提取，纯化及检测 一、【实验题目】pUC19质粒DNA的提取，纯化及检测2、 【实验目的】1. 掌握碱变性提取法提取质粒的基本原理和方法，理解各种试剂的作用。2. 掌握质粒纯化的基本原理及各种试剂的作用。3. 掌握琼脂糖凝胶电泳进行质粒检测分离的原理。4. 掌握琼脂糖凝胶电泳的制备和电泳方法。5. 掌握琼脂糖凝胶电泳的观察方法及凝胶成像仪的操作方法。三、【实验试剂与器材】1. 材料 大肠杆菌DH5（E.coli DH5） 2. 试剂 LB液体培养基，氨苄青霉素（ Amp）母液（20mg/ml），溶液，溶液，溶液，3M NaAc溶液，无水乙醇，70%乙醇，TE溶液，Rnase A,苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），灭菌双蒸水ddH2O，1TAE，6loading buffer，Supercoiled DNA Ladder Marker，-Hind III digest DNA Marker，溴化乙锭（EB）3. 仪器 培养皿，接种环，三角瓶（100ml、300ml），酒精灯，恒温振荡培养箱，50ml离心管，1.5ml塑料离心管（eppendorf管），高速离心机，漩涡振荡器，移液枪，不同型号枪头（10ul，200ul，1ml），电泳仪，微波炉，灭菌锅，吸水纸，记号笔，移液管，洗耳球，PE手套，橡胶手套，滴管，天平，称量纸，冰箱，凝胶成像仪等4、 【实验原理】1.碱变性法提取质粒及酚、酚/氯仿、氯仿/异戊醇纯化质粒质粒由于分子小、能自主复制、携带抗性基因、便于分离和提取，经常用在DNA重组中，携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达，是基因工程中一种非常重要的载体。构建重组DNA分子需要首先从宿主细胞中提取高质量的质粒DNA。提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。碱变性提取质粒DNA一般包括三个步骤：培养细菌以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4.6的KAc（或NaAc）高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可以恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。2. 琼脂糖凝胶电泳电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭或SYBR Gold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。分子生物学实验中，常用的两种凝胶为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。选择上述提及的参数或条件主要取决于被分离的DNA片段的大小。聚丙烯酰胺凝胶分辨率高，适用于较小分子核酸（5500bp）的分离和蛋白质电泳。它的分辨率非常高，长度上相差1bp或质量上相差0.1%的DNA都可以彼此分离，这也是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行DNA序列分析的分子基础。虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DNA样量，但是与琼脂糖凝胶相比，在制备和操作上还是繁琐些。聚丙烯酰胺凝胶电泳是在恒定电场中垂直方位上进行的。琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，由-D-吡喃半乳糖与1,4连接的3,6-脱水-L-吡喃半乳糖组成，相对分子质量为104105。当琼脂糖加热至90左右，即可熔化形成清亮、透明的液体，浇在模板上冷却后固化形成凝胶，其凝固点为4045。琼脂糖比聚丙烯酰胺凝胶的分辨率略低，但它的分离范围更大（50至百万bp），小片段DNA（5020000bp）最适合在恒定强度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶内电泳分离。琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA片段，进一步纯化DNA等。琼脂凝胶糖电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基团而带负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面6个因素：（1）样品DNA分子的大小：电泳时，线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的，其迁移速度与相对分子质量（所含碱基）的对数值成反比，这是因为大分子有更大的摩擦阻力。（2）DNA分子的构象：相对分子质量相同而构象不同的DNA分子，其迁移速率不同。在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA的一条链断裂，变成开环DNA，如果两条链发生断裂，就转变为线状DNA分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状分子。（3）琼脂糖浓度：琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。通常凝胶浓度越低，则凝胶孔径越大，DNA电泳迁移速度越快，因此，相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。（4）电泳所用电场：低电压条件下，线性DNA片段的迁移速率与所用电压成正比，电压越高，带电颗粒泳动越快，但随着电场强度的增加，不同长度DNA泳动的增加程度不同，因此凝胶电泳分离DNA的有效范围随着电压上升而减少。为了获得DNA片段的最佳分离效果，电场强度应小于5V/cm。（5）缓冲液：缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。当电泳液为去离子水，溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢，DNA几乎不移动；而在高离子强度下，导电性极高，带电颗粒泳动很快，产生大量的热，有时甚至熔化凝胶 或使DNA变性。电泳时常用的缓冲液有乙酸盐（TAE）、硼酸盐（TBE）和磷酸盐（TPE）几种不同的电泳缓冲液，通常配成10或5的浓缩母液保存于室温下，用时稀释至工作浓度。电泳缓冲液的工作浓度约50mmol/L，工作pH在7.57.8之间。TAE缓冲液缓冲能力弱，长时间电泳缓冲能力逐渐丧失（阳极变碱性，阴极变酸性），长时间电泳需要更换缓冲液；TBE、TPE缓冲液缓冲能力较强，可以重复使用数次。TAE缓冲液可以分离数kb长度的DNA，在精制DNA片段以及染色体DNA进行杂交时比较常用。相反，TBE缓冲液适于鉴定、分离短小的DNA片段。（6） 温度：琼脂糖凝胶电泳时，不同大小DNA片段的相对电泳迁移率在430内无变化，一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行，而当琼脂糖含量少于0.5%时，凝胶很脆弱，最好在4下电泳以增加凝胶强度。3.常用的DNA分子标准物的电泳图谱及分子大小五、【实验步骤】1.准备实验 配制LB液体培养基，分装至100ml三角瓶中20ml，300ml的三角瓶中50ml，包扎。另配LB固体培养基，包扎；准备10ul、200ul、1ml枪尖各一盒，1.5ml离心管若干于500ml三角瓶中，50ml离心管2个，移液管，包扎、标记，连同LB培养基一同灭菌。2. 菌体培养（1） 点燃酒精灯，将接种环在酒精灯上灼烧，冷却，灭菌（2） 向20ml液体LB培养中加入20ul氨苄青霉素，混合均匀。（3） 在含有氨苄青霉素的LB平板上，用接种环挑取提前活化的含有有质粒pUC19的E.coli DH5单菌落，接种于（2）的培养基中，之一接种环的圆环处在液壁交界面研磨至菌苔分散进入培养液。（4） 用棉塞塞住瓶口，用牛皮纸包住，并用绳子系紧。（5） 37，200rpm振荡培养过夜，约12h。3.扩大培养吸取菌液0.8ml转接至含氨苄青霉素的80ml LB液体培养基（Amp 100ug/ml）中，37，200rpm振荡培养6h。4.质粒提取（1） 称量一个50ml离心管的重量w1，记录为14.53g。（2） 将35ml菌液转入离心管内，标记为2-4-1。菌液应距管口1cm以防离心时菌液外溢，与其它组同学配平后，于6000rpm离心5min，弃上清。（3） 加入5ml溶液打散菌体洗涤，用漩涡振荡器混匀，于6000rpm离心5min，弃上清，称重w2为14.69g,所以菌泥重量为0.16g.（4） 向离心管中加入2.0ml溶液,充分涡旋振荡，冰浴5min。（5） 向离心管中加入4.0ml溶液，悬滴快速加入，轻柔颠倒混匀，发现离心管中的溶液变得有一些粘稠，冰浴5min。（6） 向离心管中加入3.0ml溶液，缓慢轻柔上下颠倒混匀，发现离心管中出现了白色絮状沉淀物，冰浴5min。（7） 12000rpm离心15min，将上清液轻轻转入新的离心管2，标记为2-4-2，记录上清液体积V为9ml.（8） 加入18ml冰乙醇，混匀，-20静置15-30min。（9） 12000rpm离心15min,弃上清。（10） 加入5ml 70%乙醇，12000rpm离心5min,弃上清。（11） 重复洗涤一次；吸弃上清，37风干5-10min。（12） 分次加入1mlTE溶解沉淀并转移到Ep管中，得到质粒DNA粗提物，加入50ul RNase A，37静置1-2h,-20保存待用。5.质粒纯化（1） 向上次得到的粗提物平均分装至两个Ep管中。（2） 用滴管悬滴加入500ulTris饱和酚溶液，振荡混匀，配平后于12000rpm离心5min，观察到溶液分为三层，上层澄清，中间为白色的蛋白，下层淡黄色。（3） 将上清液转入新管，记录两管的体积均为450ul。（4） 用滴管分别向两管悬滴加入450ul苯酚：氯仿：异戊醇溶液，颠倒混匀，观察到溶液分为两层，两层均是透明无色，配平后于12000rpm离心5min。（5） 将上清液转入新管，其中1号管体积为400ul，2号管体积为360ul。（6） 用滴管向1号管悬滴加入400ul氯仿/异戊醇，向1号管悬滴加入360ul氯仿/异戊醇，颠倒混匀，配平后于12000rpm离心5min。（7） 将上清液转入新管，两管转移的液体的体积均为350ul。（8） 向上清液中加