普通高中课程标准实验 生物技术实践 陈 珊 东北师范大学生命科学学院 E-mail: chens093 Tel: 0431-85098130 专题2 微生物的培养和应用 课题1 微生物的实验室培养 课题2 土壤中分解尿素的细菌的 分离与计数 课题3 分解纤维素的微生物的分离 课题1 微生物的实验室培养 实验1-1 实验室常用的消毒和灭菌方法 实验1-2 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 实验1-3 纯化大肠杆菌 实验1-1 实验室常用的消毒和灭菌方法 v 高压蒸汽灭菌 v 干热灭菌 v 灼烧灭菌 高压蒸汽灭菌 一、目的要求 1.了解高压蒸汽灭菌的基本 原理及应用范围。 2.学习高压蒸汽灭菌的操作 方法。 二、基本原理 高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压 灭菌锅内，通过加热，使水蒸气急剧地将锅内的冷空气 从排汽阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由 于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸 点升高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白质凝固 变性而达到灭菌的目的。 在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排 除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气 的膨胀压 ，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压 力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 一般培养基用0.1MPa，121.5，1530min可达到彻 底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物体 的性质和容量等具体情况有所改变。 灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系 压 力 数 全部空 气排出 时的温 度 () 2/3空 气排出 时的温 度 () l/2空气 排出时 的温度 () 1/3空 气排出 时的温 度 () 空气全 不排出 时的温 度 () MP a kg/ cm2 1b/in 2 0.03 0.07 0.10 0.14 0.17 0.21 0.35 0.70 1.05 1.40 1.75 2.10 5 10 15 20 25 30 108.8 115.6 121.3 126.2 130.0 134.6 100 109 115 121 126 130 94 105 112 118 124 128 90 100 109 115 121 126 72 90 100 109 115 121 三、操作步骤 1. 将内层锅取出，再向外 层锅内加入适量的水使 水面与三角搁架相平为 宜。 2.放回内锅层，并装入待灭 菌物品。注意不要装得太挤 ，以免防碍蒸汽流通而影响 灭菌效应，三角烧瓶与试管 口端均不要与桶臂接触，以 免冷蒸汽淋湿包口的纸而透 入棉塞。 3. 加盖，并将盖上的排器软管插入内锅层的排气槽内 。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使 螺栓松紧一致。勿使漏气。 4. 用煤气加热，待冷空气完全排尽后，关上排气阀。当锅 内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间 。本实验用0.1MPa，121.5，20min灭菌。 5. 灭菌所需的时间到后，关闭煤气，让灭菌锅内温度自然 下降，当压力表降至“0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开 盖子，取出灭菌物品。 6. 将取出的灭菌培养基放入37温箱培养24h，经检查若 无杂菌生长，即可待用。 干热灭菌 将灭菌物品放入干热灭菌箱内 ，在160170C加热12h可达 到灭菌的目的。能耐高温的、 需要保持干燥的物品，如玻璃 器皿（吸管、培养皿）和金属 用具等，可以采用这种方法灭 菌。 灼烧灭菌 将微生物的接种工具，如接种 环、接种针或其他金属工具， 直接在酒精灯火焰的充分燃烧 层灼烧，可以迅速彻底地灭菌 。此外，接种过程中，试管口 或瓶口等容易被污染的部位， 也可以通过火焰灼烧来灭菌。 接种环的灼烧灭菌（1、2、3表示先后顺序 ） 除了以上方法外，实验室里还用紫外线或化 学药物进行消毒。例如，接种室、接种箱或超 净工作台在使用前，可以用紫外线照射30min ，以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射 前，适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液， 可以加强消毒效果。 实验1-2 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢 产物的营养基质。 培养基的种类多 培养基一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐 、生长因子等。 霉菌和酵母菌的培养基的pH一般是偏酸性的，而细菌 和放线菌的培养基的pH一般为中性或微碱性的。 一、目的要求 1明确培养基的配制原理。 2通过对牛肉膏蛋白胨培养基的配制，掌握 配制培养基的一般方法和步骤。 3掌握倒平板的基本操作技术。 牛肉膏蛋白胨培养基中含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。 其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素 ，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。 在配制固体培养基时还要加入一定量的琼脂作为凝固剂 ，琼脂在96时溶化，40时凝固，通常不被微生物分 解利用。 二、基本原理 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0 g NaCl 5.0 g 琼脂 20.0 g 水 1000 ml pH 7.47.6 牛肉膏蛋白胨培养基的配方 溶液或试剂 牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂 ，lmol/L NaOH lmol/L HCl。 仪器或其他用具 试管，三角瓶，烧杯，量筒 ，玻棒，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH 试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等 。 三、实验器材 1计算 根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的比例，计算配 制100mL的培养基时，各种成分的用量。 2称量 按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋 白胨、NaCl。牛肉膏比较黏稠，常用玻棒挑取，放在称 量纸上称量，称量后直接放入水中，这时如稍微加热， 牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。牛肉膏 和蛋白胨都容易吸潮，称取时动作要迅速，称后要及时 盖上瓶盖。 四、操作步骤 3溶化 将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯，加 入少量的水，加热。当牛肉膏溶化并与称量纸分离后， 用玻棒取出称量纸。往烧杯中加入称量好的蛋白胨和氯 化钠，用玻棒搅拌，使其溶解。加入琼脂，加热使其熔 化。在此过程中，不断用玻棒搅拌，防止琼脂糊底而导 致烧杯破裂。当琼脂完全熔化后，补加自来水至100mL 。 4调pH 在未调 pH前，先用精密 pH试纸测量培养 基的原始 pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入 lmolL NaOH，边加边搅拌，并随时用 pH试纸测其 pH，直至pH达7.6。反之，用 lmolL HCl进行调节。 5加塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口 上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污 染，并保证有良好的通气性能。 6包扎 加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎 好，使用时容易解开。 7灭菌 将上述培养基和用纸包好的培养皿（58套 培养皿作一包）以 0.103 MPa 121，20min高压蒸气灭 菌。 8倒平板 待培养基冷却至50左右时，在酒精灯火 焰附近倒平板。 倒平板操作示意图 倒平板操作示意图 1. 培养基灭菌后，需要冷却到50左右时，才能用来倒 平板。你用什么办法来估计培养基的温度？ 2为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰? 五、思考题 可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温 度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 3平板冷凝后，为什么要将平板倒置? 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表 面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基 表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠 落入培养基，造成污染。 空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生 ， 因此最好不要用这个平板培养微生物。 4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与 皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？ 为什么？ 实验1-3 纯化大肠杆菌 1明确分离纯化大肠杆菌的原理。 2掌握分离纯化微生物的一般方法和步骤。 一、目的要求 v 平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划 线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面 。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来 的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落(colony)。 v 稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释， 然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的 表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一 起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面 形成单个的菌落。 二、基本原理 溶液或试剂 牛肉膏蛋白胨平板培养基 大肠杆菌悬液 仪器或其他用具 酒精灯 烧杯 涂布器 试管 移液管 接种针等 三、实验器材 四、操作步骤 1.系列稀释操作 将分别盛有9ml水的6支试管灭菌，并按101106的顺 序编号。 用移液管吸取ml培养的菌液，注入101倍稀释的试管 中。反复吹吸三次，使菌液与水充分混合均匀。 从101倍稀释的试管中吸取1ml稀释液，注入102倍稀释 的试管中，重复第2步的混匀操作。依次类推，直到完 成最后一支试管的稀释。 稀释操作示意图 稀释操作示意图 2、涂布平板操作 将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 取少量菌液（不超过0.1ml）滴加到培养基表 面。 将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒 精燃尽后，冷却810s。 用涂布器将菌液均匀的涂布在培养基表面。涂 布时可转动培养皿，使涂布均匀。 涂布平板操作示意图 涂布平板操作示意图 涂布平板菌落分离效果图 3、平板划线操作 将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。 在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞 。 将试管口通过火焰。 将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液。 将试管口通过火焰，并塞上棉塞。 左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环 迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意 不要划破培养基。 灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开 始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区 域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。 将平板倒置，放入培养箱中培养。 平板划线操作示意图 平板划线操作示意图 平板划线操作示意图 平板划线菌落分离效果图 五、结果分析与评价 1.未接种的培养基表面是否有菌落生长?如果有菌落生 长，说明了什么? 如果未接种的培养基在恒温箱中保温12d后无菌落生 长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制 备。 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致 ，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合 要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过 程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练 习。 2. 在接种大肠杆菌的培养基上，你是否观察到了独立的 菌落?这些菌落的颜色、形状和大小相似吗? 3. 培养12h和24h后，观察到的实验结果相同吗 ?如果不同，请分析产生差异的原因。 培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不 同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观 察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是 培养学生良好的科学态度与习惯。 1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微 生物污染外，还有什么目的？ 六、思考题 无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。 2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如 果需要，请选择合适的方法。 （1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手 （1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。 3.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种 环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什 么？ 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存 在的微生物污染培养物；每次划线