优胜美特制药有限公司&浙江巨泰药业有限公司-药物研究所-变更内容及定期审核版本号 生效日期 变更项目, 简述修订原因及内容00010203定期审核分发部门/人员部门/人员份数分发号一、目的制定 Agilent 1260 型高效液相色谱仪操作维护规程，使操作维护规范化，保证检测结果准确可靠。二、适用范围本规程适用于 Agilent 1260 型高效液相色谱仪的操作维护。三、职责QC 对本规程的实施负责，项目主管、研发总监对本规程实施进行监督。文件名称 文件编制及管理规程文件编号 颁发部门 研究所替代 生效日期起草人 审核人 批准人起草日期 审核日期 批准日期文件名称 文件编制及管理规程 颁发部门 研究所文件编号 页码 第 1 页 共 6 页四、程序内容4.1 仪器配置本仪器由梯度泵，自动进样器，柱温箱，VWD 检测器或 DAD 检测器和操作软件工作站组成。4.2 操 作 前 的 准 备4.2.1 流 动 相 的 制 备 用 色 谱 纯 的 试 剂 配 制 流 动 相 ， 必 要 时 照 紫 外 分 光 光 度 法 进 行 溶 剂 检查 ， 应 符 合 要 求 ； 水 为 新 鲜 制 备 的 重 蒸 馏 水 。 对 规 定 pH 值 的 流 动 相 ， 应 使 用 精 密 pH计 进 行 调 节 ， 配 制 好 的 流 动 相 应 通 过 0.45m 以 下 的 滤 膜 滤 过 ， 用 前 脱 气 ， 应 配 制 足 量的 流 动 相 。4.2.2 供 试 溶 液 的 配 制 供 试 品 用 规 定 溶 剂 配 成 供 试 溶 液 。 定 量 测 定 时 ， 对 照 品 溶 液 和样 品 供 试 溶 液 均 应 分 别 配 制 2 份 。 供 试 溶 液 在 注 入 色 谱 仪 前 ， 一 般 应 经 0.45m 以 下的 滤 膜 滤 过 ， 必 要 时 ， 在 配 制 供 试 溶 液 前 ， 样 品 需 经 提 取 净 化 ， 以 免 对 色 谱 系 统 产 生 污染 。4.2.3 检 查 上 次 使 用 记 录 和 仪 器 状 态 ， 检 查 色 谱 柱 是 否 适 用 于 本 次 试 验 ， 色 谱 柱 进 出 口位 置 是 否 与 流 动 相 的 流 向 一 致 ， 原 保 存 溶 剂 与 现 用 流 动 相 能 否 互 溶 ， 流 动 相 的 pH 值与 该 色 谱 柱 是 否 相 适 应 ， 仪 器 是 否 完 好 ， 仪 器 的 各 开 关 位 置 是 否 处 于 关 断 的 位 置 。4.3 仪器的操作4.3.1 接 通 电 源 ，打开计算机及工作站其他各部件开关，约 30 秒后，各部件进入待机状态，指示灯为橘黄色，启动完成。4.3.2 用鼠标双击企业仪器启动程序界面上的 Agilent1260 仪器图标进入 Agilent1260 LC 在线色谱工作站，该页面主要由以下几个部分组成：4.3.2.1 最上方为命令栏，依次为文件,控制,方法，分析，序列，数据等；4.3.2.2 命令栏下方为快捷操作图标，如多个样品连续进行分析、新建方法序列、单个样品分析、调用文件、保存文件等；4.3.2.3 左部有五栏从上到下依次为方法，序列，报告，控制，视图五栏。4.3.2.3.1 用鼠标单击【方法】栏进入仪器方法界面，有仪器设置、积分事件、前处理、手动积分修正、平铺显示等。下面介绍以上部分方法的功能。4.3.2.3.1.1 仪器设置：控制运行样品时各部分组件满足的要求，如柱式加热炉的温度.梯度泵的流速，溶剂比例，停止时间，压力限值。检测器的检测波长。自动进样器的进样量。辅助图谱的记录等。4.3.2.3.1.2 积分事件：用于样品的积分，有很多参数控制样品的积分，如阈值、最小面积、宽度、积分关闭等。4.3.2.3.1.3 用鼠标单击【序列】栏进入序列编辑界面。4.3.2.3.1.4 用鼠标单击【报告】栏进入建立报告界面，有归一化，面积百分比，内标法，外标法等报告格式。4.3.2.3.1.5 用鼠标单击【控制】栏进入仪器控制界面，有仪器设置，运行队列，仪器状态三项。下面介绍以上三项的控制功能。4.3.2.3.1.5.1 仪器设置：控制运行样品时各部分组件满足的要求，如柱式加热炉的温度.梯度泵的流速，溶剂比例，停止时间，压力限值。检测器的检测波长。自动进样器的进样量。辅助图谱的记录等。4.3.2.3.1.5.2 运行队列：控制样品运行的顺序。也是提交单针和序列的界面，下面介绍提交样品运行的方法。在运行队列界面上单击鼠标右键出现单次运行/单次分析，序列运行/序列分析等栏，提交单次运行需单击右键后停留在单次运行项后单击鼠标左键，出现单文件名称 文件编制及管理规程 颁发部门 研究所文件编号 页码 第 2 页 共 6 页次运行对话框，出现以下几栏，样品 ID（样品名称） ，方法，数据路径，数据文件（数据名称） ，样品瓶等，单击方法图标，调用已保存在系统内运行样品的方法（即以上介绍的仪器设置） ，单击数据路径图标将数据保存在你可找到的文件夹内，将数据文件命名，设置好分析对应进样盘的样品瓶后，即可以提交即将要分析的样品了，优先提交即走完当前样品后第一针样品。区别： 手动 提交每次做样之前必须给出新名字，否则仪器会将上次的数据覆盖掉。4.3.2.3.1.5.3 仪器状态：体现仪器运行/预运行/空闲时的状态。单击仪器状态一栏，从左至右依次是自动进样器梯度泵柱温箱检测器的状态，橘黄色为未就绪状态，绿色为空闲状态，粉色为进样状态，蓝色为运行状态，红色为出错状态。4.3.2.3.1.5.3.1 自动进样器：是系统提交的提取规定位置的样品瓶的执行者，也是吸取样品瓶中定量的样品的操作者。4.3.2.3.1.5.3.2 梯度泵：体现流动相的流动速度和整个系统的压力，A 、B 两相的比例。4.3.2.3.1.5.3.3 柱温箱：体现色谱柱所在柱温箱的温度。4.3.2.3.1.5.3.4 检测器：体现样品运行时的检测波长。4.3.2.3.1.6 用鼠标单击【视图】栏出现数据显示，数据，平铺显示三项。4.3.2.3.1.6.1 数据显示下有显示所有数据，平铺数据，重叠数据，在线信号等。显示所有数据：即打开运行样品时所有记录运行状态的数据图谱。平铺数据：即将所有运行状态图谱平铺。重叠数据：即将所有运行状态图谱重叠。4.3.2.3.1.6.2 数据下有手动积分修正，基线检查状态。4.3.2.3.1.6.3 平铺显示下有样品录入。4.3.2.3.1.7 视图下还有一栏：即控制左部五栏的出现和隐藏。4.3.2.3.1.8 最下面一栏为手动积分修正一栏，出现很多操作图标，如积分关闭、分割峰、定义单峰、手动峰等。4.4 色谱条件的设定及数据采集操作过程4.4.1 从化学工作站菜单的 仪器状态 的启动 系统 ，也可点击桌面左下方上的 接通系统电源按钮，还可以点击每一模块图标中的控制来开或关。把泵上的 Purge 阀逆时针松开，调流速为 3.0ml/min,启动泵，系统开始排气泡，直到管线内（由容器瓶到泵出口）无气泡为止，切换通道继续 Purge，直到所用流动相通道中无气泡为止，调流速为 1.0ml/min，再把Purge 阀顺时针旋紧。4.4.2 流动相设置：单击泵左面的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积，也可输入阻止分析和关泵的流动相体积底限，单击确定。4.4.3 进样及方法的设定: 4.4.3.1 点击化学工作站菜单的 方法 中 新建方法 。4.4.3.2 柱温箱参数设定：在温度下面的方框内输入温度，选中“与泵和进样器一致” 使柱温箱温度一致，单击确定进入下一画面。4.4.3.3 泵参数设定：在流速处输入流量，在溶剂 B 处输入另一溶剂体积百分比(A=100-B)，也可插入一行时间表编辑梯度，在“最大压力限度” 处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子，单击确定进入下一画面。4.4.3.4 VWD 检测器参数的设定文件名称 文件编制及管理规程 颁发部门 研究所文件编号 页码 第 3 页 共 6 页在“波长”下方的空白处输入所需的检测波长，如 254nm，在“ 峰宽（响应时间） ”下方点击下拉成三角框，选择合适的响应时间，如0.1min（2 秒响应时间） 。点击确定进入下一画面。4.4.3.5 自动进样器参数设定：在进样量输入进样量，选择洗针进样,输入洗针瓶位置，单击确定进入下一画面。4.4.3.6 DAD 检测器参数的设定参数设定 检测波长：一般选择最大吸收处的波长，最多可同时检测 8 个波长。样品带宽：一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域。参比带宽：至少要与样品信号的带宽相等，通常情况下用 100nm作为缺省值。可以根据所需保存光谱图的张数最多同时设定 5 个通道采集信号，无需采集光谱时应将“ 存储” 设在 “无”，若做峰纯度检测或优化求知的样品检测条件，建议选择“全部”。峰宽（响应时间）：其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。狭缝：窄时，光谱分辨率高；宽时，噪音低。同时可以输入采集光谱方式，步长，范围，阈值。根据检测波长选择氘灯或钨灯。4.4.3.7 单击“ 方法” 菜单，选中 “方法另存为”，输入一方法名。如 “test”，单击确定。4.4.3.8 从菜单 视图 中选出 在线信号 ，选中 信号窗口 1，然后单击 改变 按钮，将所要绘图的信号移到右边的框中，点击确定。 （如同时检测两个信号，则重复 1、2，选中 信号窗口24.4.3.9 自动进样序列设定：在系统内保存即提交序列的方法，单击文件下拉菜单中 序列并找到 序列向导 ，选择已保存在系统中的仪器设置方法，单击确定进入下一对话框，输入样品信息：样品总体名称，数据路径中为将数据保存在规定文件夹中，在样品名称项中输入样品名称，未知样品运行次数项中输入样品瓶数，在每次运行重复次数输入进样针数，单击确定进入下一对话框，在样品瓶项中输入第一个样品瓶的位置，在样品架上放入样品瓶，在进样量选项中选择使用方法，然后单击确定。出现一个有样品瓶数的序列，将每一个样品名称都区别开来，以防保存数据时将相同名称的数据覆盖掉，将序列保存在规定文件夹中，在运行队列中进行提交。4.4.3.10 等仪器 ready，基线平稳，从 运行控制 菜单选择运行序列进样。4.4.4 采样进程中可进行的操作4.4.4.1 当出峰时间超过设定的分析停止时间时，可以点击右下部的工作参数“停止时间” 进行适当的调整，可使主峰出完并与使杂质峰出完。4.4.4.2 中止采集4.6 图谱数据的处理4.4.5 从 文件 命令栏中选择 打开文件 选项，选中你要的数据文件名，单击确定。4.4.6 从 方法 菜单中，单击 积分事件 进入积分参数画面。进行修改积分参数后在命令栏内选择分析。文件名称 文件编制及管理规程 颁发部门 研究所文件编号 页码 第 4 页 共 6 页4.4.7 将图谱优化，选择 自定义报告 进入报告编辑。可将谱图设置在任何量程区域内，也可以将谱图调节成任何颜色，在数据结果中单击鼠标右键选择报告属性将需要的积分参数选入，如理论塔板数，分离度等。在报告结果中就会出现应保存的结果。4.4.8 打印报告：在打印报告之前，要将此方法保存后在 报告 菜单中选择 打印报告 ，将打印机的型号选择对，则 报告 已 打印 出来。4.5 关机操作4.5.1 清洗柱和流路：反相色谱系统先用 10%甲醇水以 1ml/min 冲洗 20min 以上（如流动相中没有盐可直接用甲醇冲洗）再用甲醇冲洗 15min。如果流动相中有盐先用 10%乙腈水以 1.0ml/min 冲洗 60min 以上，再用乙腈冲洗 20min,甲醇冲洗 20min。4.5.2 清洗完成后，先将流速降到 0，先关闭工作站，再依次关闭仪器各部件开关，断开电源。4.5.3 填写仪器使用记录。4.6 注意事项：4.6.1 流动相必须用色谱纯的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂