8.3 食品中常规项目的微生物检验 8.3.1食品中菌落总数的测定 菌落总数的定义 菌落总数：是指食品检样经过处理，在一 定条件下培养后，所得1g或1mL或1cm2表 面积检样中所含细菌菌落的总数。 测定原理： 菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件 下培养后（如培养基成分，培养温度和时间， PH，需氧性质等），所得1ml (g) 检样中所含 菌落的总数。本方法规定的培养条件下所得结 果，只包括一群在培养琼脂上生长的嗜中温性 需氧的菌落总数。菌落总数主要作为判定食品 被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察 细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进 行卫生学评价时提供依据。 一、实验目的 1、学习或均技术的技术方法； 2、掌握食品细菌总数的测定报告方式。 二、实验材料 1、电热恒温培养箱、冰箱、恒温水浴锅、托 盘天平、电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、玻 璃珠、平皿、试管、试管架、酒精灯、均质 器或乳钵、灭菌刀或剪刀、灭菌镊子、75%酒 精棉球、玻璃蜡笔、登记薄 2、培养基和试剂：75%乙醇、生理盐水、15% 氢氧化钠溶液、营养琼脂培养基 实验二 食品中细菌总数的测定 1、检验程序 菌落总数检验程序： 检样做成几个适当倍数的稀释液 选择2-3个适宜稀释度各以1ml之量 分别入灭菌平皿内每皿内加入460C 适量营养琼脂菌落数报告 三、实验方法 （1）以无菌操作，将检样25g（或25ml）剪碎以后，放于含 有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内 预先置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研 磨做成1：10的均匀稀释液。 固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以 8000r/min100000r/min的速度处理1min，做成1：10的均匀 稀释液。 （2）用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入 含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释的试管内（注意吸管尖端 不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，做成1 ：100的稀释液。 （3）另取1ml的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释 液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。 2、检样稀释及培养 （4）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估 计，选择23个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀 释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于 灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。 （5）稀释液移入平皿后，应及时将凉至460C营养琼 脂培养基可放置在（461）0C）水浴锅内保温 注入平皿15ml20mL，并转动平皿使混合均匀，同 时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品 ）的灭菌平皿内作空白对照。 （6）等琼脂凝固后，翻转平板，置（361）0C恒 温箱内培养（482）h取出，计算平板内菌落数目 乘以倍数，即得1g（1mL）样品所含菌落总数。 3、菌落计算方法 （1）菌落计数方法 做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜 检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释 度的各平板平均菌落总数。 （2）菌落计数的报告 平板菌落数的选择 选取菌落数在30300之间的平板作为菌落总数测定标 准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数， 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应 以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状 菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀 ，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。平皿内如有 链状菌落生长时（菌落之间无明显界线），若仅有一条链 ，可视为一个菌落数；如果有不同来源的几条链，则应将 每条链作为一个菌落计。 稀释度的选择 应选择平均菌落数在30300之间的稀释度， 乘以稀释倍数报告之。若有两上稀释度，其生长的 菌落数均在30300之间，则视两者之比如何来决 定。若其比值小于或等于2，应报告其平均数；若 大于2则报告其中较小的数字。 若所有稀释度平均菌落数均大于300，则应按 稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按 稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以 最低稀释倍数报告之。 若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之 间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近 30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 菌落数的报告 菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于 100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面 的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后 面的零数，也可用10的指数来表示。 8.3.2食品中大肠菌群的测定 大肠菌群的定义:大肠菌群并非细菌学分类命名 ，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个 或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组 与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血 清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼 性厌氧、在3724 h能分解乳糖产酸、产气、 需氧和兼性厌的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠 檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群=大肠杆菌吗？ 大肠菌群包括大肠杆菌。大肠菌群指能 够发酵乳糖产酸产气的革兰氏阴型无芽 孢杆菌。 大肠埃希氏菌(E. coli)习惯称为大肠杆 菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌 属。 大肠菌群的卫生意义 大肠肠菌群数的高低，表明了粪粪便污污染的 程度，也反映了对对人体健康危害性的大小 。 食品中有粪粪便污污染，则则可以推测该测该 食品 中存在着肠肠道致病菌污污染的可能性，潜伏 着食物中毒和流行病的威胁胁，必须须看作 对对人体健康具有潜在的危险险性。 国标法 国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵 试验、分离培养和证实试验。 乳糖发发酵试验试验 ：样样品稀释释后，选择选择 三个稀释释度， 每个稀释释度接种三管乳糖胆盐发盐发 酵管。361培 养242h，观观察是否产产气。 分离培养：将产产气发发酵管培养物转转种于伊红红美蓝蓝 琼琼脂平板上，361培养18-24h，观观察菌落形态态 。 证实试验证实试验 ：挑取平板上的可疑菌落，进进行革兰兰氏 染色观观察。同时时接种乳糖发发酵管361培养 242h，观观察产产气情况。 报报告：根据证实为证实为 大肠肠杆菌阳性的管数，查查MPN 表，报报告每100ml（g）大肠肠菌群的MPN值值。 实验三 食品中大肠菌群的测定 一、实验目的 1、学习食品中大肠菌群检测程序、方法； 2、掌握食品中大肠菌群检测结果的报告方式。 二、实验材料 1、设备和材料 温箱、水浴锅、天平、显微镜、均质器或乳钵、温 度计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种 针 2、培养基及试剂 乳糖胆盐发酵管、乳糖发酵管、蛋白胨水、靛基 质试剂、麦康凯、伊红美蓝琼脂（EMB）、远腾氏琼 脂、革兰氏染色液 三、实验方法与步骤 1、采样及稀释 以无菌操作将检样25g（或25ml）放于含有225ml灭 菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置 适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研 磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用无菌均 质器，以8000r/min10000r/min的速度处理1min， 做成1：10的稀释液。 用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，注入含有9ml 灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇混匀，做 成1：100的稀释液，换用1支1ml灭菌吸管，按上述操 作依次作10倍递增稀释液 根据食品卫生要求或对检验样品污染情况估计，选 择三个稀释度，每个稀释度接种3管。也可直接用样 品接种。 2. 乳糖初发酵试验 即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中 有无发酵乳糖产生气体的细菌。 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在 1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；1ml及1ml以下 者，用单料乳糖发酵管。每一个稀释度接种3管，置 （361）0C温箱内，培养（242）h，如所有乳糖 胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如 有产生者，则按下列程续进行 3.分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板或麦 康凯琼脂平板上，置（361）0C温箱内，培养18h 24h，然后取出，观察菌落形态并作革兰氏染色镜 检和复发酵试验。 4.乳糖复发酵试验 即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖 初酵管试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性 无芽胞杆菌，确能发酵乳糖产生气体。 在上述的选择性培养基上，挑取可疑大肠菌群1 2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置（ 361）0C的温箱内培养（242）h，观察产气情况 。 凡乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性无芽胞杆 菌，即报告为大肠杆菌阳性；凡乳糖发酵管不产气 或革兰氏染色为阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。 5.报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表 ，报告每100ml（g）食品中大肠菌群的最可能数。 8.3.3粪大肠菌群的检验 根据国家颁布的食品卫生微生物检验标准方法 (GB4789.3-1994)，粪大肠菌群系指一群能在 44 24h内发酵乳糖产酸产气和利用色氨酸产 生靛基质，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽 孢杆菌。表8-3中的大肠艾希氏菌I型即属粪大 肠菌群。粪大肠菌群的唯一来源是粪便，因此 ，唯有粪大肠菌群是粪便污染的确切指标。在 被检样品中，如果有粪大肠菌群存在，则在大 肠菌群检验中也被计入。因此，也有将大肠菌 群数称为总大肠菌群数者。 8.3.4沙门氏杆菌的检验 沙门氏杆菌是一群形态和培养特性都类似的肠 杆菌科中的一个大属，也是肠杆菌科中最重要 的病原属，它包括将近2 000个血清型。沙门 氏菌病常在动物中广泛传播，人的沙门氏菌感 染和带菌也非常普遍。由于动物的生前感染或 食品受到污染，均可使人发生食物中毒。世界 各地的食物中毒中，沙门氏菌食物中毒常占首 位或第二位。沙门氏菌常作为进出口食品和其 他食品的致病菌指标。因此，检查食品中的沙 门氏菌极为重要。 8.3.5志贺氏杆菌的检验 志贺式菌属的细菌通称为痢疾杆菌，是细菌性 痢疾的病原菌。临床上能引起痢疾症状的病原 微生物很多，如志贺氏菌属、沙门氏菌属、变 形杆菌属、艾希氏菌属等，还有阿米巴原虫、 鞭毛虫及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志 贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。人类对志 贺氏菌的易感性较高，所以在食物和饮用水的 卫生检验时，常以是否含有志贺氏菌作为指标 。 志贺氏菌属是由四个亚群组成，即A、B、C 、D四个亚群。 8.3.6致病性葡萄球菌的检验 典型的葡萄球菌呈球形，直径0.41.21m； 致病性葡萄球菌一般较非致病性菌小，且各个 菌体的大小及排列也较整齐。细菌繁殖时呈多 个平面的不规则分裂，堆积成为葡萄串状排列 。在液体培养基中生长，常呈双球或短链状排 列，易误认为链球菌。葡萄球菌无鞭毛及芽孢 ，一般不形成荚膜，易被碱性染料着色，革兰 氏染色阳性，当衰老、死亡或被白细胞吞噬后 常转为革兰氏阴性，对青霉素有抗药性的菌株 也为革兰氏阴性。