实验4 醋酸纤维薄膜法分离血清蛋白质 一 、实验目的 n掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质的原理和方 法。 二、实验原理 利用带电粒子在电场中移动速度不同而分离的技术称为电 泳技术。 醋酸纤维薄膜电泳(CAME)是以醋酸纤维薄膜(CAM)作支 持物的一种区带电泳技术，醋酸纤维（即二乙酸纤维素）薄 膜具有均一的泡沫状结构（厚约120m），渗透性强，对分 子移动无阻力，故可用它作区带电泳的支持物，具有用样量 少，分离清晰，无吸附作用等优点。目前可用于血清蛋白、 脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。 将血清样品点样于醋酸纤维膜上，在pH 8.6的缓冲液中 电泳，血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋 白组分等电点不同而致表面净电荷量不等，分子大小和形 状各异，氨基酸组分、立体构象和相对分子量不同，因而 电泳迁移率不同，彼此得以分离。电泳后，CAM经染色和 漂洗，可清晰呈现清蛋白、1、2、球蛋白5条区 带。 在一定的范围内，蛋白质的含量与结合的染料量呈正比 ，故可将各蛋白质区带剪下，分别用0.4 mol/LNaOH溶液浸 洗下来，进行比色，测定其相对含量。 表 血清中各蛋白组分的等电点和相对分子量 清 三、实验试剂和材料 血清：抗A血清（医用） 巴比妥-巴比妥钠缓冲溶液（pH8.6） 染色液：1氨基黑10B染料 漂洗液 浸出液 透明液 醋酸纤维薄膜：28 cm，厚度120m 用普通的薄载玻片自制点样器 直流稳压电泳仪，水平电泳槽 薄膜的准备 电泳槽的准备 点样 电泳 染色与漂洗脱色 四、实验操作流程 .准备和点样： 在浸泡薄膜前应辩清薄膜的正反面，因为浸泡打湿后不易辩别正反 面。 在距膜一端1.5cm用铅笔作好标记，将薄膜漂在缓冲液液面上，迅 速湿润，整条薄膜一致而无白点。然后用竹镊子将薄膜轻轻完全浸入 缓冲液中，待膜完全浸透后使用(约0.5h)。 然后将薄膜制作电桥：将电泳缓冲液倒入电泳槽两边，平衡两边液 面。根据电泳槽的纵向尺寸，剪裁尺寸合适的滤纸条,附着在电泳槽的 支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电泳槽的缓冲 液内。然后，用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支 架上，即为“滤纸桥”。按照同样的方法，在另一个电极槽的支架上 制作相同的“滤纸桥”。它们的作用是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲 液之间的中间“桥梁”。 用竹镊子取出充分浸透(膜上没有白色斑痕)的薄膜，夹在两层粗滤纸 内，吸去多余的缓冲液，然后平铺 (无光泽面朝上). 用注射器吸取少量血清滴在一干净玻片上，用自制的点样器的截面蘸 一下血清液滴，再将样品“印”在薄膜无光泽面的点样区(距薄膜一端 1.5cm处)。使血清均匀分布在点样区，完全渗透于膜内,形成具有一定宽 度、粗细匀称的直线。 事先可在滤纸上练习点样，掌握点样技术，这是获得具有清晰区带 的电泳图谱的重要环节之一。 将点好样的薄膜 (无光泽面朝下)两端紧贴在支架的滤纸桥上(加血清 端靠负极)，中部悬空平直。加上槽盖平衡10min，仔细检查电泳装置的 线路是否正确，然后通电。 .电泳条件 电压90-110V，电流0.4-0.6mA/cm2，通电时间45-60min。泳动距离 约达3.5-4.0cm时即可断电。 .染色 电泳完毕，将醋酸纤维薄膜浸于1氨基黑10B染料中染色5-10min， 然后取出，投入漂洗皿中用漂洗液反复漂洗至背景无色（约4-5次） 。 .处理及保存 染色，洗脱后，浸于蒸馏水中约5-10min，用滤纸吸干，然后夹于书 本中即可作短期保存。 五、实验结果与讨论 对电泳区带结果进行分析讨论。 一般经漂洗后，薄膜上可呈现清晰的 5条区带，由正 极端起，依次为清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、 球蛋白、球蛋白。 1、据人血清中各蛋白质的性质，如何估计它 们在pH8.6巴比妥电泳缓冲液中的相对迁移 速度? 2、简述醋酸纤维薄膜电泳的优点。