The key of Prokaryotic protein expression and purification 北京全式金生物技术有限公司 ：400-898-0321 原核表达概述 原核表达策略选择 表达结果验证 常见问题与实验例 上篇 原核表达 原核表达原理概述 表达载体 表达菌株 表达条件 原核表达概述 原核表达原理概述 表达载体 目的基因 重组载体 表达菌株 “基因载体菌株培养” 培养，诱导 构建转化 表达载体 启动子 融合标签 常用表达载体系统 常见见启动动子 pL启动动子：热诱导热诱导 启动动子 trp启动子：化学诱导启动子 trc启动子：trp+lac杂交启动子 tac启动子：trp+lacUV5杂交启动子； pGEX（Pharmacia）、pMal（NEB） T7/T7lac启动子：pET（Novagen）、pEASY-E1/E2（Transgen） T7启动子 T7lac启动子 融合标签 常用于蛋白检测检测 与纯纯化。 有时时也可增加蛋白可溶性、将蛋白运转转至特定位置。 N端融合：易于构建。终终止密码码子来自载载体/基因 表达量高 提前终终止会干扰纯扰纯 化 二级级翻译译起始不影响纯纯化 C端融合：构建时时注意避免移码码 基因不能自带终带终 止密码码子 提前终终止不影响纯纯化 二级级翻译译起始会干扰纯扰纯 化 常用融合标签标签 HisTagpET系统统 GSTTagpGEX系统统 MBPTagpMal系统统 系统名称公司启动子抗性常用标签特点 pGEXGE (Pharmacia ) tacAmpGSTTag可溶性表达，纯化难以控制，谷可溶性表达，纯化难以控制，谷 胱甘肽胱甘肽 一步洗脱，得到的蛋白纯一步洗脱，得到的蛋白纯 度较低度较低, ,通常需要去掉通常需要去掉GSTGSTTagTag pMalNEBtacAmpMBPTag可溶性表达，纯化难以控制，麦可溶性表达，纯化难以控制，麦 芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度 较低较低, ,通常需要去掉通常需要去掉MBPMBPTagTag pETMerck (Novagen) T7 T7lac Amp Kan HisTag 种类丰富。标签小，无需切割，种类丰富。标签小，无需切割， 一般来说，对蛋白活性无影响。一般来说，对蛋白活性无影响。 纯化及其方便。纯化及其方便。 pEASYTransgenT7lacAmpHisTag同pET系统 常用表达载体系统 表达菌株 考虑因素细胞特性 蛋白稳定性蛋白酶缺陷型B型菌株，缺失lon、ompT蛋白酶 多种常用表达菌株均为此类，如BL21、Origami、Rosetta等 启动子tac启动子需要大肠杆菌自身的RNA聚合酶即可：BL21 T7启动子需要能够提供T7 RNA聚合酶的细胞：DE3溶源菌 抗性细胞不能与载体带有相同的抗性： pET-28a + OrigamiB(DE3)No！ pET-21b + OrigamiB(DE3)Yes！ 严谨调控BL21(DE3)pLysS / BL21(DE3)pLysE 稀有密码子Rosetta系列 溶解性Origami系列 稀有密码子 不同生物使用密码子存在偏爱性。某种或某几种tRNA的缺乏，会导致外源目的基因 的mRNA 无法正常在E. coli 里表达，是为“稀有”密码子。 表达条件 乳糖操纵纵子与诱导诱导 物 常用表达条件的优优化 乳糖操纵子与诱导物 1980年，Guarante L等构建了以乳糖操纵子为基础的大肠杆菌表达系统 Guarante L, Roberts TM, Ptashne M. A technique for expression eukaryotic genes in bacteria. Science, 1980, 209: 14281430 启动子Plac + 操纵基因lacO + 结构基因 lacI负调控： 阻遏物lacI与操纵基因lacO结合，抑制表达 IPTG：半乳糖苷类似物，结合阻遏物lacI使其失活，启动诱导表达 cAMP-CAP正调控 cAMP结合并激活CAP，起始转录，实现正调控 葡萄糖抑制腺苷酸环化酶，ATP不能转化为cAMP，无cAMP-CAP，无转录 常用表达条件的优化 培养基组分 温度 IPTG浓度 OD值 培养体积与溶氧量 根据实验目的选择表达策略 载体选择 感受态细胞选择 表达条件 原核表达策略选择 根据实验目的选择表达策略 1. 明确实验目的 2. 选择表达载体 3. 选择表达菌株 4. 优化表达条件 实验目的表达策略 活性分析可溶表达 制备抗原包涵体 高纯度融合标签 结构研究天然蛋白 选择表达载体 系统名称公司启动子抗性常用标签特点 pGEXGE (Pharmacia ) tacAmpGSTTag可溶性表达，纯化难以控制，谷可溶性表达，纯化难以控制，谷 胱甘肽胱甘肽 一步洗脱，得到的蛋白纯一步洗脱，得到的蛋白纯 度较低度较低, ,通常需要去掉通常需要去掉GSTGSTTagTag pMalNEBtacAmpMBPTag可溶性表达，纯化难以控制，麦可溶性表达，纯化难以控制，麦 芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度 较低较低, ,通常需要去掉通常需要去掉MBPMBPTagTag pETMerck (Novagen) T7 T7lac Amp Kan HisTag 种类丰富。标签小，无需切割，种类丰富。标签小，无需切割， 一般来说，对蛋白活性无影响。一般来说，对蛋白活性无影响。 纯化及其方便。纯化及其方便。 pEASYTransgenT7lacAmpHisTag同pET系统 选择表达菌株 菌株适合启动子特性 BL21tac、trc (pGEX、pMal) 适用于非T7启动子的表达系统 BL21(DE3)T7/T7lac (pET，pEASY) 适用于T7、T7lac的表达系统，适用于非毒基因 的表达 BL21(DE3)pLysST7/T7lac (pET，pEASY) 质粒pLysS含有表达T7溶菌酶的基因，可结合T7 RNA聚合酶，降低本底表达水平。适用于严谨 调控毒基因的表达 Rosetta(DE3) Transetta(DE3) T7/T7lac (pET，pEASY) 补充6种稀有密码子对应的tRNA，提高外源基因 ，特别是真核基因在原核系统中的表达水平 OrigamiB(DE3) TransB(DE3) T7/T7lac (pET，pEASY) 具有thioredoxin reductase/glutathione reductase 双突变，有助于形成更多的二硫键，增加蛋白的 可溶性。 毒基因：基因表达产物即目的蛋白，影响宿主生长（“毒性”） Page Down Page Up BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE利用T7溶菌酶的严谨调控机制 优化表达条件 葡萄糖：抑制cAMP形成，进而抑制表达，严谨调控 无其他严谨调控手段（pLysS）且毒基因时，至关重要！ 温度：影响表达速率、蛋白可溶性与活性 IPTG浓度：影响表达速率、蛋白可溶性与活性 lac透性酶(lacY1)突变使IPTG均一渗透，获得浓度依赖 的诱导：Tuner，OrigamiB，Rosetta 其他因素：菌体密度 Mg2+ 培养体积与通气 ArtMediaTM Protein Expression（AM PE） 葡萄糖抑制cAMP形成，无cAMP-CAP，不能正调控乳糖操纵子，因而无法利 用乳糖，使得大肠杆菌优先利用葡萄糖 AM PE中含有特定配比的葡萄糖与乳糖，利用该机理，使得葡萄糖耗尽开始摄 入乳糖时，控制细菌恰好生长到适合诱导的阶段（对数期），利用乳糖代谢， 启动自动诱导！ 无需监控菌体生长，实现自动诱导 无需加入IPTG，对细菌生长无抑制 细胞密度高，蛋白产量高 应用于一切乳糖操纵子表达系统：pET、pGEX、pMal、pEASY 4123 pET28a,30 kDa 1：ArtMedia 2：LB 3：LB+0.2% Glucose 4：SOB 载体：pEASY-E1 蛋白：70 kDa 菌株：Transetta(DE3) Lane 1: LB培养基，对照 Lane 2: LB培养基，IPTG诱导 Lane 3: AM-PE自动诱导 载体：pGEX-5X-3蛋白：70 kDa 蛋白：30kDa 菌株：BL21 Lane 1: LB培养基，IPTG诱导 Lane 2: AM-PE自动诱导 Lane 3: LB培养基，对照 123 123 表达定位 表达结果验证 溶解性信号肽活性免疫原性产量纯化难度 胞内表达可溶/包涵体不需要有/无有最高 50% 蛋白种类多，需裂解 菌体，复杂 周质表达多为可溶需要有有较少 4% 蛋白种类少，需渗透 压休克，相对容易 胞外分泌完全可溶需要有有变化 较大 纯化简单。但机理不 详，成功先例少 表面展示融合膜蛋白/ 嵌合于膜上 需要-有-适用于疫苗开发、抗 体制备，前景广阔。 表达定位 菌液 离心 菌体细胞总蛋白 培养基组分 悬菌，渗透压休克 菌体 细胞周质组分 悬菌，裂解，离心 胞质可溶组分 沉淀 溶解，离心胞质不溶组分 沉淀 沉淀上清全菌 可溶表达 沉淀上清全菌 包涵体 常见问题与实验例 无表达或表达量低 蛋白不可溶 蛋白纯化障碍 无表达或表达量低 载体-菌株搭配不当 摸索最佳的组合 载体启动子菌株 pGEXtacBL21 pMaltacBL21 pETT7/T7lacBL21(DE3) BL21(DE3)pLysS Rosetta(DE3) OrigamiB(DE3) pEASYT7lac同上 无表达或表达量低 稀有密码子 影响：翻译终止，移码突变，氨基酸序列错误，表达量低或无表达 应对：在宿主中补充稀有密码子的tRNA Rosetta系列菌株（Novagen公司） 1：BL21(DE3)； 2：Rosetta(DE3) ； 3：BL21(DE3)pLysS 目的蛋白 M123 无表达或表达量低 毒基因 影响：宿主中质粒不稳定、抑制生长或杀死宿主（溶菌）、表达量低或无 表达 应对：严谨调控启动子，抑制本底表达 选择特殊的载体（pETcoco） 选择特定的宿主菌（BL21(DE3)pLysS，BL21(DE3)pLysE ） 优化培养条件与诱导表达条件 包涵体表达 123 pET28a Lane 1：Rosetta(DE3) Lane 2：BL21(DE3)pLysS Lane 3：BL21(DE3) 蛋白不可溶 成因：蛋白质正确折叠，形成有活性、有功能的天然构象的程度。 定位：可溶蛋白胞质，细胞周质，胞外（培养基） 包涵体胞质，细胞周质 特点：可溶蛋白天然构象，正确折叠，具有生物活性 包涵体高浓度，高纯度，无活性，具免疫原性，不易水解 增加可溶表达 原理手段 促进正确折叠融合催化二硫键形成酶的标签 选择促二硫键形成的细胞（Origami系列菌株） 分泌表达细胞周质表达，胞外分泌 融合表达融合溶解性高的标签（GST，MBP） 控制表达水平诱导温度 IPTG浓度 “假”包涵体 （疏水区域，膜结合等） 特殊裂解缓冲液（去垢剂，盐，核酸酶） 123 Lane 1：37 Lane 2：30 Lane 3：25 12 pET pGEX 促进包涵体形成 目的高浓度，高纯度 毒基因表达 免受蛋白酶水解（小蛋白，多肽） 手段胞质表达 提升表