中国医科大学 博士学位论文 姜黄素对肺癌细胞增殖、凋亡、促血管生成和放射敏感性的作 用及其机制的体外研究 姓名：郑伟 申请学位级别：博士 专业：病理学 指导教师：杨向红 20070401 英文缩略语 3 5 中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获 得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢 意 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：逸曼塑垄日期：丝2 ：坐叶 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生 在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕 业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学， 且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅 和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ， 以采用影印，缩印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 中文论著摘要 姜黄素对肺癌细胞增殖、凋亡、促血管生成和放射敏 感性的作用及其机制的体外研究 前言 肺癌是世界上发病率及死亡率较高的恶性肿瘤之一，手术是I 一期非小细胞 肺癌的主要治疗手段，但至少有5 0 的术后患者会发生局部复发或远处转移，有 7 0 的患者不适合再次手术治疗，放化疗及分子靶向治疗成为其主要的治疗手段， 但长期使用毒性大费用高又影响其疗效。人们试图从中药有效成分中寻找一种高 效、低毒，能抑制肿瘤细胞增殖诱导其凋亡且对放射具有增敏作用的药物，从而 为肺癌的临床治疗提供一种新途径。 姜黄素( C u r c u m i n ，C u r ) 是从姜科姜黄属植物姜黄( c u r c u m a l o n g a ) 根茎中 提取的一种酚类色素，大量研究表明，姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种 生物学功能，且价格低廉，毒性很低( 小鼠L D s o 为2 9 K g ) ，目前对其抗肿瘤作用 的研究主要集中在肿瘤的化学预防方面。最近美国N C I 已将其列为第三代防癌药 进行临床研究。国内外对姜黄素抗促癌机制的研究主要集中在以下7 个方面： 抗诱变及抗N O 作用。对表皮生长因子受体E G F R 、P K C 信号转导通路的影响。 下调核转录因子，抑制i N O S 、C O X 2 活性。调控癌基因和抑癌基因的表达。 诱导细胞周期阻滞。抑制脲激酶( u P A ) 活性和M M P 9 的分泌。抑制肿瘤 血管生成。 有关姜黄素对肺癌抗癌作用的研究国外仅限于通过调控肺癌细胞癌基因和抑 癌基因表达促其凋亡及抑制血管生成因子表达来抑制肺癌血管生成等；而国内未 见相关报道。本课题从诱导凋亡、抑制肿瘤血管生成、放射增敏三个方面观察姜 黄素在体外对肺癌A 2 细胞的作用并通过检测B c l 2 、B a x 、s u r v i v i n 、P 5 3 、F a s 、 V E G F 、M M P 一9 、e y c l i n B l 、P 3 4 凇、p h o s P 3 4 出、P 2 1 及N F k B 蛋白表达活性改 变及A n g - 1 、A n g 一2 和T S P 的m R N A 水平的变化从分子水平探讨其机制。 一、姜黄素抑制人肺癌细胞( A 2 ) 生长、诱导凋亡的作用及其机 制 ( 一) 实验方法 1 、细胞培养 用含1 0 ( v o l v 0 1 ) 5 6 C 灭活胎牛血清的R P M l l 6 4 0 培养基，3 7 C 饱和湿度、 5 C 0 2 的培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长，实验取对数生长期细胞。 2 、M T T 法药物敏感试验 消化细胞接种于9 6 孔培养板，培养2 4 h 后，分别加入含不同浓度姜黄素的 R P M l l 6 4 0 培养液1 0 0 1 d ，使姜黄素的终浓度为5 、1 0 、2 0 、4 0 ，6 0 、8 0 、1 0 0 和 2 1 6 0 p m o l L ，培养4 8 h 后，每孔加入5 m g m l M T T 2 0 p 1 ，用酶标仪检测O D 值，检 测波长为4 9 0 n m 。采用S P S S 统计分析软件，应用直线回归法计算I C 5 0 3 、A n n e x i n F I T C 标记法定量检测细胞凋亡 收集细胞，清洗，离心，加入结合b u f f e r ，重悬细胞。取1 9 5 “! 细胞重悬液， 加5 山A n n e x i n F I T C ，室温孵育l O 分钟。清洗细胞，离心，弃上清，加入1 9 0 1 d 结合b u f f e r ，重悬细胞。加入1 0 t a l2 0P , g m l 的P r o p i d i u mI o d i d e 。用F A C S c a n 检 测细胞膜外表面磷脂酰丝氨酸结合蛋白的表达及死亡细胞D N A 含量。 4 、细胞凋亡的形态学检测 细胞经2 5 戊二醛、1 锇酸双固定，梯度乙醇和丙酮脱水，E p o n S l 2 树脂 包埋超薄切片机( A O 型) 切片，醋酸钠和柠檬酸铅双重染色，J E M 一1 2 0 0 E X 和H 一6 0 0 型透射电镜下观察并拍照。 5 、细胞总D N A 的提取及琼脂糖凝胶电泳 收集细胞，重悬，离心，去上清，重复一次；加入细胞裂解液5 0 0 肛1 重悬细 胞，5 0 C 水浴3 5 小时震荡，离心，吸取水相于另一离心管中，加入1 1 0 体积 3 M N a C L 和两倍体积乙醇混匀，沉淀D N A ，去上清，7 0 乙醇漂洗1 2 次，风扇 吹干残存液体，加入5 0 1 1 1 含1 0 0 p 9 m l R N A s e A 的T E 缓冲液，6 5 * ( 2 3 0m i l l ；取8 山 加上样缓冲液上样，1 8 琼脂糖凝胶电泳，采用1 - 5 V e m 电压降，用凝胶成像系 统观察和扫描成像。 3 6 、W e s t e r nb l o t 检测A 2 细胞凋亡相关蛋白B c l 2 、B a x 、P 5 3 、 s u r v i v i n 、F a s 收集细胞，裂解，测蛋白浓度，定蛋白，1 0 S D S P A G E 电泳，转印，T B S 封闭，转到B e l 2 、B a x 、P 5 3 、F a s 及s u r v i v i n 一抗4 C ，过夜。二抗孵育。T T B S 冲洗两次，每次1 5 分钟，转到H R P 一标记的羊抗鼠I g G ( 1 ：5 0 0 0 ) 、羊抗兔 I g G ( 1 ：5 0 0 0 ) 、马抗羊I g G ( 1 ：5 0 0 0 ) 的二抗中，孵育2 小时。用E C L 化学发光检测， X 一片感光。 ( 二) 结果 l 、M T T 法药物敏感试验 姜黄素对A 2 细胞的抑制作用呈浓度依赖性，计算4 8 小时的I C 5 0 值为 4 0 1 1 m o l L 。 2 、细胞凋亡的形态学检测 透射电镜下观察，对照组A 2 细胞中细胞核及线粒体、内质网等结构清晰， 核占细胞体积的大部分。姜黄素作用于A 2 细胞后可见细胞核固缩、碎裂、无核 膜包被；核染色质边集于胞膜，核孔消失；正在形成的凋亡小体和已形成的凋亡 小体等超微结构改变。 3 、A n n e x i n F I T C 标记法定量检测细胞凋亡 分别收集姜黄素4 0 1 a m o l L 作用2 4 小时、4 8 小时、7 2 小时及正常对照组的细 4 胞进行A n n e x i nV - F I T C 标记结合流式细胞仪检测细胞凋亡。发现姜黄素作用2 4 小时、4 8 小时，A 2 细胞凋亡比例较低，分别为9 4 5 、1 6 8 9 ；7 2 小时细胞凋 亡比例较高，为2 1 0 5 。 4 、D N A 琼脂糖凝胶电泳 分别收集姜黄素4 0 m o l L 作用2 4 小时、4 8 小时、7 2 小时及正常对照组的细 胞进行D N A 琼脂糖电泳。4 8 小时，凋亡细胞的D N A 由于D N A 降解成规则的大 片段出现凋亡特有的“梯状”条带，7 2 小时，细胞大多已经坏死，坏死细胞由于其 D N A 的不规则降解显现一条连续的膜状条带。而正常活细胞D N A 基因组条带由 于分子量大，迁移距离短，所以停留在加样孔附近 5 、W e s t e mb l o t t i n g 分别收集姜黄素4 0 1 u n o l L 作用6 小时、1 2 小时、2 4 小时、4 8 小时及正常对 照组的细胞，提取总蛋白，检测凋亡相关蛋白P 5 3 、B c l 一2 、B a x 、F a s 、s u r v i v i n 的 表达，发现随时间的延长，B a x 、P 5 3 、F a s 蛋白表达水平逐渐升高。而B e l 一2 、s u r v i v i n 蛋白表达水平逐渐降低。 总之：姜黄素诱导肺癌细胞株A 2 细胞凋亡是多靶点，多途径的，其与凋亡 相关基因的改变、细胞因子的分泌等密切相关。 二、姜黄素对血管生成的作用及其机制的研究 ( 一) 实验方法 5 1 、细胞培养 用含1 0 ( v o l v 0 1 ) 5 6 C 灭活胎牛血清的R P M l l 6 4 0 培养基，3 7 C 饱和湿度、 5 C 0 2 的培养箱中培养，H U V E C 、A 2 细胞呈单层贴壁生长，实验取对数生长 期细胞。 2 、M T T 法观察姜黄素对H U V E C s 增殖的影响 细胞接种于9 6 孔培养板，培养2 4 h 后，分别加入含不同浓度姜黄素的 R P M l l 6 4 0 培养液l O O 肛1 ，使姜黄素的终浓度为5 、1 0 、2 0 、4 0 ，6 0 、8 0 、1 0 0 和 1 6 0 1 a m o l L ，每组设三个复孔，培养4 8 h 后，每孔加入5 m g m lM T r2 0 1 x l ，继续培 养4 h 后，吸去上清液，加入1 5 0 I _ t lD M S O 液，震荡培养板1 0 m i n ，用酶标仪检测 O D 值，检测波长为4 9 0 n m 。细胞增殖抑制率( ) = 【1 ( 实验组的O D 值空白组 的O D 值) ，( 阴性对照组的O D 值空白对照组的O D 值) X 1 0 0 3 、A n n e x i n F I T C 标记法定量检测细胞凋亡 消化收集细胞，加入结合b u f f e r ，重悬细胞，调整细胞数为5 1 0 5 m l 。取1 9 5 r d 细胞重悬液，加5 “IA n n e x i n F I T C ，室温孵育，清洗细胞，离心后弃上清，加入 1 9 0 1 s l 结合b u f f e r ，重悬细胞。加入1 0 山2 0p g m l 的P r o p i d i u mI o d i d e 。用F A C S c a n 检测细胞膜外表面磷脂酰丝氨酸结合蛋白的表达及死亡细胞D N A 含量。 4 、逆转录P C R 检测血管生成素1 和血管生成素2 ( A n g 一1 、A n g 一2 ) 和血小板反应素( T S P ) 的m R N A 水平 6 细胞总R N A 提取，采用紫外光谱扫描仪检测总R N A 纯度；逆转录；P C R 产物分析：取P C