实验：蛋白质免疫印迹检测 Caspase-3 的活化 预习报告 （北医综合实验） 一、一、Western Blot 实验原理实验原理 Western Blot (蛋白质免疫印迹法)是将经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白 质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维索薄膜NC 膜)上，固相载体以非共 价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肤类型及其生物学活性不变。然后 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与相应的第抗体(一抗)发生抗原抗体 免疫反应，一抗再与酶或同位素标记的第二抗体发生免疫反应，经过底物显色或 放射自显影来检测电泳分离的目的蛋白。此方法是分子生物学、生物化学和免疫 遗传学中常用的一种实验方法，可以定性研究目的蛋白的相对分子质量，或者定 量检测目的基因蛋白水平的表达。 通常，Western Blotting 的实验操作包括两部分： 1. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPolyacrylamide Gel Electrophoresis， SDS-PAGE) (1)聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称 Acr)和少量交联剂 N，N甲叉双 丙烯酰胺(简称 Bis)，通过化学催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂四甲基乙二胺 (TEMED)的化学聚合作用交联聚合形成的三维网状结构的高聚物。以此为支持 物的电泳就称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis，简称 PAGE)。 聚丙烯酰胺凝胶的浓度大时，形成的网孔孔径小，适于分离相对分子质量较 小的物质，反之，要分离相对分子质量较大的物质就需要选择较小的凝胶浓度。 凝胶浓度与被分离物质的相对分子质量(Mr)大小的关系，大致范同如表 7-1： (2)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶电泳根据其有无浓缩效应， 分为连续系统连续系统和不连续系统不连续系统两大 类。连续系统电泳体系中缓冲液的 pH 值及凝胶的浓度相同，带电粒子在电场作 用下， 主要靠电荷效应和分子筛效应进行分离。不连续系统中缓冲液的离子成分 和 pH 值、凝胶浓度及电位梯度都具有不连续性，带电粒子在电场中的泳动不仅 依赖电荷效应和分子筛效应，还依靠浓缩效应，因而其分离的条带清晰度及分辨 率均比连续系统高。 不连续系统的凝胶由浓缩胶和分离胶两部分组成。浓缩胶浓度较小，聚合而 成的是大孔径胶，具有堆积作用，凝胶缓冲液为 pH6.8 的 TrisHCI，分离胶的 浓度大，聚合而成的是小孔径胶，凝胶缓冲液为 pH8.9 的 TrisHCI。两种孔径 的凝胶、两种缓冲体系、两种 pH 值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH 值、缓 冲液离子成分的不连续性。 凝胶缓冲液和样品缓冲液选 TrisHCl 缓冲液，电极缓冲液为 Tris甘氨酸 缓冲液。 电泳缓冲液中的 HCl 易解离出 Cl-， 它在电场中迁移率大， 走在最前面， 故称为快离子或前导离子。 电极缓冲液中的甘氨酸在浓缩胶 pH6.8 的缓冲液中解 离度很小，因而在电场中迁移率很小，称为慢离子或尾随离子。实验材料血清中 的大多数蛋白质等电点 pI 在 5.0 左右， 在 pH8.3 或 pH6.8 时均带负电荷， 在电场 中移向正极，其有效迁移率介于快慢离子之间。电泳开始时氯离子泳动率最大， 超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生 较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成稳定的界面，使蛋白聚 集在移动界面附近，浓缩成一中间层。当进入 pH8.9 的分离胶时，甘氨酸解离度 增加，其有效迁移率超过蛋白质，氯离子和甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。 而蛋白质分子因相对分子质量大，被留在后面。蛋白质由于相对分子质量不同在 分离胶内受到的摩擦力不同，泳动率也不同。此外，各蛋白质由于 pI 不同，在 同一 pH 值条件下所带的净电荷不同，表而电荷越多，在电场中的泳动越快，反 之，越慢。由此，蛋白质混合物根据相对分子质量相对分子质量和净电荷的不同净电荷的不同慢慢地被分成 多个区带。 (3)SDSPAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳是利用蛋白质相对分子质量的大小、 蛋白质的形状和所 带净电荷多少三种因素来分离蛋白质组分的， 所以无法通过 PAGE 来计算目的蛋 白的相对分子质量。1967 年 Shapiro 等人发现，在电泳体系中加阴离子去污剂十 二烷基硫酸钠(简称 SDS)和强还原剂 巯基乙醇之后，当蛋白质的相对分子质 量介于15200kD时， 蛋白质的电泳迁移率与相对分子质量的对数呈线性关系， 并符合下列的方程： 式中：Mr为蛋白质的相对分子质量，Rf为相对迁移率，K 为直线的截距，b 为斜率。 实验证明， 在 SDS-PAGE 电泳体系中加入的 巯基乙醇可以还原蛋白质分 子中的二硫键：而 SDS 是一种阴离子表面活性剂，在电泳体系中起以下作用： 破坏蛋白质分子内以及分子之间的氢键和疏水键。另外，强还原剂巯基乙醇打 开了蛋白质分子内的二硫键，蛋白质就解聚成为亚基(或多肽链)。SDS 充分结 合解聚后的蛋白质分子而形成带负电倚的蛋白质-SDS 复合物，复合物所带的负 电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量， 因而掩盖了不同蛋白质分子之间原有 的电荷差异。蛋白质-SDS 复合物还引起了蛋白质构象的改变，在溶液中的形 状像一个长椭圆棒。椭圆棒的短轴对不同的蛋白质亚基-SDS 复合物基本上是相 同的(约 18m)，但长轴的长度则与蛋白质 Mr的大小成正比。因此这种复合物在 SDSPAGE 系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要 取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质及其亚基 Mr的大小。 (4)蛋白质标准曲线的制作 设定浓缩胶和分离胶的界线为起点，溴酚蓝前沿为终点，计算每种标准蛋白 质的相对迁移率(Rf)。 以各已知蛋白质的相对迁移率(Rf)为横坐标， 它们 Mr的对数为纵坐标绘制蛋 白质标准曲线。 目的蛋白 Mr的计算：测量和计算出目的蛋白的 Rf值，根据蛋白质标准曲线 计算出目的蛋白的 Mr。需要注意的是，在凝胶电泳中影响蛋白质迁移率的因素 很多，在制胶和电泳过程中，很难使每次的实验条件完全一致，所以用 SDSPAGE 法测定 Mr时，每次测定样品必须同时做标准曲线。 2. 免疫印迹免疫印迹 经 SDSPAGE 电泳分离的蛋白条带通过电转移法从 SDSPAGE 凝胶内部 转移到 NC 膜上，实现了蛋白分子的表面化。然后采用一抗特异性识别目标蛋白 并与其结合，再用过氧化物酶标记的二抗与一抗结合，最后加入过氧化物酶的底 物显色，根据颜色的深浅和面积，可以估计被测蛋白的含量。 由图 7-3 可知， Western Blotting 测定目的蛋白是通过一抗和二抗的间接检测 法，此方法有以下优点： 二级抗体可测定多种多样的一级抗体从而避免了逐一标记一级抗体； 一抗通常能与几个二抗分子结合， 从而起了信号放大的作用。 因此 Western 印迹法检测蛋白的灵敏度大大提高，理论上敏感度为 15 ng。 缺点：一抗可能会与二抗发生交叉反应，产生非特异性条带；检测过程增加 了额外的温育步骤。 免疫印迹的具体操作流程如下： (1)电转移(electric transfer) 使用转移电泳槽将蛋白质条带从聚丙烯酰胺凝胶上电转移到硝酸纤维素膜 (NC 膜)上。 (2)封闭(Blocking) 用非特异性蛋白质(不与抗体结合)封闭 NC 膜上没有吸附蛋白质的空白区， 使特异性抗体只与膜上的相应抗原蛋白质条带结合 (3)第一抗体结合 第一抗体与抗原蛋白质条带特异性结合。 (4)第二抗体结合 偶联了过氧化物酶(HRP)的第二抗体与第一抗体特异性结合。 (5)显色反应 加入催化剂过氧化氢后，酶底物二氨基联笨胺(DAB)与过氧化物酶标记的蛋 白质区域产生红棕色沉淀。 注：Western Blot 显色的方法主要有以下几种： 放射自显影； 底物化学发光 ECL； 底物荧光 ECF； 底物 DAB 呈色。 1 二、二、Western Blot 实验步骤实验步骤 （一）样品的制备（一）样品的制备 1.将HL-60细胞分别传代在两个直径3.5cm的培养皿中， 培养24h至密度约60%。 2.将实验组的细胞加入一定量的足叶乙苷，使之终浓度为 20M，同时将对照组 细胞加入同体积的二甲亚砜（DMSO） 。 3.作用 24-48h 后，将培养基移至 15ml 离心管中，800rpm，4离心 5min。弃上 清，并加入冰 PBS 重悬细胞，800rpm，4离心 5min，弃上清，再加入冰 PBS， 重复上述步骤两次。 4.弃上清，加入 200l 细胞裂解液，冰上充分裂解 30min。 5.将细胞裂解液以最大转速 4离心 15min， 取上清， 加入 50l 蛋白上样缓冲液。 6.将样品置于 90-95水浴锅孵育 5-10min，放于冰上准备电泳。 （二）（二）样品的样品的 SDS-PAGE 制备制备 1.垂直板电泳装置的安装。 2.聚丙烯酰氨凝胶的制备： （1）15%分离胶（共 10ml） 30%丙烯酰胺贮存液 5.0ml ddH2O 2.3ml 1.5M Tris-HCL 溶液（pH=8.8） 2.5ml 10%SDS 0.1ml 10%过硫酸铵 0.1ml 混匀后加入 5-8LTEMED，立即混匀，灌入安装好的垂直夹层玻璃板中至 距离顶部 2cm 处，立即在胶液上面加盖一层双蒸水，静置，待分离胶聚合后（约 20min） ，去除胶面的水分。 （2）5%浓缩胶： 30%丙烯酰胺贮存液 0.63ml ddH2O 3.0ml 0.5M Tris-HCL 溶液（pH=6.8） 1.25ml 10%SDS 0.05ml 10%过硫酸铵 0.05ml 混匀后加入 3-4LTEMED， 立即混匀， 灌入垂直夹层玻璃板中至玻璃板顶端， 插入梳子，静置，待胶聚合后拔去梳子，用电极液冲洗加样孔。 3.上样 4.电泳：在电泳槽内加上 1 电泳缓冲液后开始电泳。开始电泳时，电压为 8V/cm 凝胶 （约 80V 左右） ， 待样品进入分离胶后， 增加电压至 15V/cm （约 120V 左右） 。 继续电泳至溴酚蓝抵达分离胶底部，断开电源。 5.取下胶板，小心去除一侧玻璃板，切去浓缩胶和分离胶无样品部分。 （三）（三）蛋白质转膜蛋白质转膜 1.精确测量剩余胶的大小，按该尺寸剪取一张硝酸纤维素膜和八张滤纸 2.硝酸纤维素膜在电转缓冲液中浸泡 3min 3.在电转移槽中由阳极到阴极按下列顺序依次安放： 电转移缓冲液浸湿的滤纸 2 张； 硝酸纤维素膜； 凝胶； 电转移缓冲液浸湿的滤纸 2 张； 4.接通电源，100V 恒压，1 小时 （四）（四）封闭封闭 将转膜后的硝酸纤维素膜在 TBS 中漂洗一下，放入装有封闭液的平皿中， 室温轻摇 1 小时。 （五）（五）一抗结合一抗结合 1.将滤膜放入杂交盒中； 2.加入 2ml 封闭液和 2l 一抗（1:1000 稀释比） ； 3.置 4水平摇床摇动过夜。 （六）（六）二抗结合二抗结合 1.取出滤膜，用 TBST 漂洗三次，每次 5min； 2.将滤膜再放入杂交盒中； 3.加入 2ml 封闭液和 0.2l 二抗（1:10000 稀释比） 4.置室温水平摇床避光摇动 1 小时。 （七）（七）显色反应显色反应 1.取出滤膜，用 TBST 漂洗 2 次，再用 TBS 漂洗 1 次，每次各 5min； 2.将有蛋白条带的滤膜面朝上，放在保鲜膜中； 3.将两种显色底物 A 液和 B 液按 1:1 等体积