河北农业大学 硕士学位论文 玉米大斑病菌信号转导途径中ras基因的克隆与功能研究 姓名：王妍 申请学位级别：硕士 专业：植物病理学 指导教师：董金皋 2009-06-10 摘 要 由玉蜀黍凸脐蠕孢真菌引起的玉米大斑病是当今玉米生产上的重要病害之一， 经 常会造成严重的经济损失。目前的试验研究表明，许多植物病原真菌的生长、发育、 蛋白的输出和分泌都受到细胞外信号转导途径的调控， 如 Ras、 MAPK、 cAMP 及 Ca2+ 途径等，这些信号转导途径对植物病原真菌生长发育以及致病性均有重要的调节作 用。其中，Ras 蛋白位于 MAPK 信号转导通路的上游，ras 基因在进化中高度保守， 广泛存在于各种真核生物中，如：哺乳动物类、真菌、线虫及酵母中。遗传学、生物 化学以及分子生物学等方面的试验研究表明，Ras 在细胞外刺激所产生的信号转导通 路中处于中枢地位。因此，深入研究 Ras 蛋白的功能有利于研究病菌的发育和侵入机 制等，同时对研究病菌与寄主植物之间的互作以及有关植物病害防治、方法具有重要 的理论意义。本试验对玉米大斑病菌的 Ras 蛋白进行了初步研究，主要结果如下： 1. 根据已知的植物病原真菌 ras 基因的保守序列设计引物，采用 PCR 扩增技术 获得玉米大斑病菌 ras 基因的同源片段， 利用 Genome walking 技术获得了 ras 基因的 DNA 全长序列。利用 BLASTX 软件对该基因的全长序列进行分析，结果表明该序列 与 Pyrenophora tritici、Phaeosphaeria nodorum SN15、Magnaporthe grisea 的 ras 基因 同源性为 80%90%。 2. 利用 ras 基因特异性抑制剂手霉素 A 处理玉米大斑病菌，对 Ras 蛋白的功 能进行了初步分析。结果表明，经手霉素 A 处理后，病菌可以形成与野生型同样正 常的菌丝和分生孢子，但分生孢子萌发的时间发生延迟、且芽管短小、粗大；分生孢 子萌发率和附着胞产生数量明显下降。 用 20120 mol/L 浓度的手霉素 A 处理 636 h 后，在此处理区间范围内，手霉素 A 对分生孢子萌发和附着胞产生的抑制程度随着 浓度增加而上升，但随着处理时间的延长而下降。 3. 进一步利用DNAMAN软件分析了ras基因片段的酶切位点， 并且基于pSO- 质粒构建了玉米大斑病菌 ras 基因的反义诱导表达载体，为下一步原生质体转化研究 功能做好准备。 关键词：玉米大斑病菌；信号转导；ras 基因；手霉素 A Cloning and functional analysis of ras gene in signal transduction pathway of Setosphaeria turcica Author: WANG Yan Major: Plant Pathology Supervisor: DONG Jin-gao Abstract Northern Corn Leaf Blight, caused by Setosphaeria turcica, is one of the most important diseases in corn planting area. Current research indicated that the growth of many plant pathogenic fungi, was subject to extracellular control signal transduction pathways, such as Ras, MAPK, cAMP and Ca2+ signals, especially the MAPK pathway on growth and development of plant pathogenic fungi and this signal transduction was an important pathogenic regulating factor. Ras protein was located in MAPK signal transduction pathway upstream, ras genes were highly conserved in evolution, widely existed in various eukaryotes, such as mammals, drosophila, fungi, nematodes and yeast. Genetics, biochemistry and molecular biology studies indicated that Ras in cells generated by stimulation of the signal transduction pathway in a central position. Therefore, in-depth study of the function of Ras protein was conducive to study the occurrence of disease, development and invasive mechanisms, the study of pathogenic fungi and host plants as well as the interaction between plant disease prevention and treatment also had important theoretical significance. Here we did some research on Ras protein of Setosphaeria turcica in its function regulating pathogenesis, the main results were as follows: 1. As the basis of ras gene of the known plant pathogenic fungi designed primer which using PCR amplification. And then use the Setosphaeria turcica homologous ras gene fragments for Genome walking, amplify the ras gene sequence. The use of the BLASTX sequence analysis software, the results show that the homology of ras sequence in Pyrenophora tritici, Phaeosphaeria nodorum SN15, Magnaporthe grisea are 80%90%. 2. The specific inhibitors of ras gene manumycin A was used to study the fuction of ras gene in Setosphaeria turcica. The results showed the characteristics of hyphae and conidia of the fungus treated with manumycin A were similar with its wild-type isolate, but conidia germination time delayed, and the germ tube shorten; the number of conidia germination rate and cell adhesion declined markedly. With 20120 mol/L concentration of manumycin A to deal with 636 h after the interval in the scope of this deal, the manumycin A and attachment of conidia germination inhibition of cell generated increases as the concentration, however, with the extension of the processing time decreased. 3. The use of DNAMAN software for further analysis of ras gene fragments restriction sites and based on plasmid pSO-. The construction of ras antisense expression vector of Setosphaeria turcica was for Ras function analysis. Key words: Setosphaeria turcica; signal tranduction; ras gene; Manumycin A 缩写词表缩写词表 Tris Tris（Hydroxymethyl）Aminomethane三（羟甲基）氨基甲烷 DIG Digoxigenin 地高辛 MAPK Mitogen-activated Protein Kinase 丝分裂原蛋白激酶 PDA Potato Sugar Agar 马铃薯蔗糖培养基 ORF Open Reading Frame 开放阅读框 CTAB Cetyl Trimethy Ammonium Bromide 十六烷基三甲基溴化铵 ddH2O Double Distilled Water 双蒸水 dNTP Deoxynucleotide Triphosphates 脱氧核苷三磷酸 EB Ethidium Bromide 溴化乙锭 EDTA Ethylenediamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸 PCR Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应 PEG Polyethylene glkycol 聚乙二醇 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 河北农业大学河北农业大学 或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 河北农业大学河北农业大学 有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。 本人授权河北农业大学河北农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 （保密的学位论文在解密后适用本授权书） 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 电话： 通讯地址： 邮