资源预览内容
第1页 / 共49页
第2页 / 共49页
第3页 / 共49页
第4页 / 共49页
第5页 / 共49页
第6页 / 共49页
第7页 / 共49页
第8页 / 共49页
第9页 / 共49页
第10页 / 共49页
亲,该文档总共49页,到这儿已超出免费预览范围,如果喜欢就下载吧!
资源描述
第五节第五节 化学蛋白质组学化学蛋白质组学 人类基因组计划的顺利实施,使生命科学研究的重心逐渐转移到对生物 功能的整体研究上。对生物功能的主要体现者或执行者-蛋白质的表达 模式和功能模式的研究必然成为生命科学发展的趋势。 在20世纪90年代中期,国际上萌发了一门研究 细胞内各种蛋白质的组成及其活动规律的新兴 学科-蛋白质组学(proteomics)。 蛋白质组(proteome)这一概念是1995年由澳大 利亚学者最先提出来的,源于蛋白质( protein)与 基因组(genome)两个词的杂合 ,指的在一个特定的时间和空间内,一个基因 组一种细胞组织或一种生物体所表达的全部 蛋白质。 对蛋白质组问题的研究称之为蛋白质组学 (proteomics),主要是在整体水平上研究细胞 内蛋白质的组成及其活动规律。 而化学在这里再一次与生物学的最新发展融合,形成新的 交叉研究领域-化学蛋白质组学(chemical proteomics)。 化学蛋白质组学是一个目前仍在不断扩展中的全新领域, 学术界至今对其尚未有确切定义。一定程度上,化学蛋白 质组学可以理解为“化学加蛋白质组学”。 具体地说,由于大多数蛋白质的功能直接依赖于小分子配 体与靶蛋白的结合步骤,因此,利用能够与靶蛋白质特异 作用的化学小分子来扰动和探测蛋白质组,有可能在蛋白 质组的整体水平上,揭示感兴趣的特定蛋白质的功能以及 它们与化学小分子的相互作用 化学蛋白质组学利用化学小分子直接从功能角度切入蛋白 质组的研究,有别于以往的主要以蛋白质定性定量鉴定为 基础的蛋白质组学技术,因此,被认为是很有前途的新一 代功能蛋白质组学技术(function-based proteomics)。 一,化学蛋白质组学的研究方法 蛋白质组学从整体上对体系内蛋白质进行研究 ,常见3种研究模式: 第1种是检测蛋白质组理化参数的“完全蛋白质 组学”; 第2种是差异蛋白质组学,主要通过比较分析不 同状态下蛋白质表达图谱,实现对体系内代谢 调控的动态监测,从而更易于揭示机体对内外 界环境变化产生反应的本质规律; 第3种主要是蛋白质功能模式的研究,包括蛋白 质的功能及蛋白质间的相互作用。 化学蛋白质组学的主要任务在于,发展和应用具 有生物活性的靶向探针,用于复杂的蛋白质组中 的特异性酶或蛋白质家族的功能研究。小分子与 细胞内靶蛋白质的相互作用,是很多蛋白质生物 功能的基础。这种相互作用强弱不一,既可以是 可逆的,也可以是不可逆的;可以是单靶点的, 也可以是同时作用于多个靶蛋白的。 生物体(细胞 组织等)蛋白质组的所有蛋白质经化 学小分子处理前后的差异蛋白质组展示(proteome profiling),可以用来研究这种相互作用。对化 学学科而言,通过功能蛋白质组学的研究服务于 人类的健康,促进分子医学的发展,如寻找先导 药物以及药物的靶分子是其重要的目标。 (一)蛋白质组学的基本技术流程 目前,蛋白质组 学研究通常有三 个步骤:第一, 运用双向电泳技 术分离样品中的 蛋白质;第二, 应用质谱技术鉴 定通过双向电泳 分离出来的蛋白 质;第三,应用 生物信息学技术 存储、处理、比 较获得的数据。 1,双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 1975年Ofarrell和Klose首先在两个实验室分别建立了 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-DE电泳), 其基本原理是利用不同蛋白质具有不同等电点(pI)和不 同分子量大小的特点将它们分离。 他们将高分辨率的等电聚集电泳(isoelectrofocusing, IEF)和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)联合组成双 向电泳,第一向为IEF,采用经典的两性电解质载体在 电流作用下形成pH梯度,依据pI的不同进行分离;第二 向利用SDS-PAGE根据分子量大小进行分离。 2,基质辅助激光解吸电离-飞行 时间质谱技术 基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱测量法以 多肽质量/电荷比为依据同数据库资料进行比较, 进而对蛋白质进行鉴定。此法通常被称为肽质量 指纹法。 3,色谱与质谱联用技术 将色谱技术与新型质谱技术相结合,可有效地克服双向 凝胶电泳/质谱的不足,确保了分析的准确性。 首先对蛋白质混合物进行酶切得到混合肽段,然后通过 强离子交换反相色谱柱进行多次分离,并连用液相色谱- 串联质谱分析肽段,而且通过核素标记肽段的技术实现 蛋白定量分析。分离后的产品离子得到完好地扫描,连 用分析肽段,可以区分待测蛋白质和其他类似物。 4,信息查询 生物信息学(Bioinformatics)是生物与计算机 以及应用数学相互结合而形成的一门新兴学科 。它通过对生物学实验数据的获取、加工、存 储、检索与分析,达到解释数据所蕴含的生物 学意义的目的。 蛋白质组学研究任一物种的基因组编码的全套 蛋白质,它通常是高通量的,在进行蛋白质功能 预测和结构分析时,生物信息学就成为蛋白质 组学研究的核心技术之一。 常用几种软件进行分析。 PeptIdent是以肽质量指纹谱数据鉴定蛋白质的查询软 件,是将数据库中的所有蛋白质用我们选定的酶进行“理 论消化”形成肽片段,计算其理论肽段质量,建立索引,然 后再与输入的实验数据进行对比,按实验数据匹配数的 多少排列并输出匹配结果。蛋白质的等电点、分子量和 种属可以详细限制候选蛋白,减少假阳性误差。 MS-Fit和Mascot软件利用了MOWSE得分法,特别考虑数据 库中肽段分布频率的问题。Mascot软件还把MOWSE得分 转换为绝对概率,减少结果的不确定性。 蛋白质组学相关网站 http:/www.proteomeworks.bio- 蛋白质组研究技 术、信息等。 从新药开发角度,发现 新蛋白及新作用。 http:/www.proteome.med.umich.edu 可以找到蛋白质组 研究相关企业、各 种仪器来源、新闻等。 http:/www.proteome.co.uk 各种蛋白质组研究相关信息 http:/www.micromass.co.uk 介绍蛋白质鉴定的先进仪器 http:/www.expasy.ch 蛋白质鉴定专家系统,Swiss Institute of Bioinformatics http:/expasy.proteome.org.au 蛋白质鉴定专家系统, Australian Proteome Analysis Facility http:/expasy.cbr.nrc.ca 蛋白质鉴定专家系统,Canadian Bioinformatics Resours 二、功能蛋白质组学技术 功能蛋白质组学主要是研究蛋白质功能、蛋白质蛋白质 相互作用、蛋白质小分子相互作用,其方法主要有蛋白 质阵列技术(protein arrays)、噬菌体展示技术(phage display)、基因芯片技术(cDNA micr-oarray)、酵母双杂 交技术等。 而通过筛选小分子配体来描述新蛋白的功能,是化学蛋白 质组学的主要研究内容,化学蛋白质组筛选也将提供新药 开发的先导化合物。共价结合于目标蛋白质、便于纯化和 鉴定的化学探针,无疑是该领域最为重要的工具。可利用 化学探针在纯化的蛋白质、细胞裂解物、活细胞和活动物 等不同水平,评价药物作用强度和选择性。一方面,可鉴 别与不同疾病相关的新型药物靶点;另一方面可用于药物 先导化合物的快速鉴定,从而加快候选化合物应用于临床 的进程。其中基于靶酶活性的特异化学小分子探针 (activity-based probes,ABPs)是一种新的化学蛋白质组 学研究技术。 activity-based probes,ABPs 该技术的原理是:合成同时带有反应基团和标签基团的 ABPs试剂与待研究的蛋白质组作用(ABPs中的反应基团 能够特异性共价修饰蛋白质组中的某类酶蛋白而将化学 小分子“挂”到感兴趣的靶酶上,然后,利用ABPs中的荧 光或生物素标签基团又可将这些靶酶一个个地从蛋白质 组中“钓”出来)。由于ABPs是针对待研究靶酶的活性而 定向设计的化学小分子,因而能够直接检测蛋白质组中 感兴趣的靶酶的活性。 ABP 的分子量通常在 700-1000 D,这主要是由于报告 基团(荧光基团或生物素)造成的,这些报告基团还可能 改变活性分子在体内的性质及其与靶蛋白的作用模式, 并因此限制了ABP分子在体内细胞的吸收与分布。ABPP 实验一般都是在体外进行的,如细胞或组织匀浆液,这 种实验方式可能会改变细胞或组织内活性酶或非活性酶 的浓度及它们各自的亚细胞分布。因此,体外的功能蛋 白质组学研究只能大致地揭示活细胞或动物体内组织中 蛋白质的功能状态。 1,不可逆探针 就其主要基础性结构而言,不可逆的化学探针具有三种特 异的功能部位:与酶共价交联的反应基团,调节反应基团 反应特异性的链接区和一个便于鉴别和纯化目标酶的标记 物。 (1)反应基团 反应基团为靶蛋白质提供必要的共价修饰,其选择性的高 低是化学探针设计过程中的最大的挑战 其难度在于功能基 团的二元性,一方面具有特定蛋白质中氨基酸残基的反应 性,另一方面不识别细胞或细胞抽提物的其他活性片段。 (2)链接区 通常采用长链烷或聚乙二醇作为化学探针的链接区,连接 反应基团和标记物。主要在反应基团和标记物之间提供足 够的空间以阻止空间障碍的形成,便于反应基团与酶的结 合以及对结合物的纯化。烷基链可调节探针的疏水性,使 其便于进入活细胞和组织;而聚乙二醇链可提高疏水探针 的溶解性,便于进入水溶液。 (3)标记物 一般选用生物 素、荧光物质 和放射性物质 作为化学探针 的标记物,可 快速鉴别和纯 化探针所修饰 的蛋白质。蛋 白质凝胶电泳 是最简单有效 的蛋白质分离 方法,因此用 于标记探针的 物质应兼容于 SDS-PAGE法。 目前,该方法已成功地分别用于针对丝氨酸蛋白酶,巯基蛋白酶,去泛 蛋白化酶等靶酶的功能蛋白质组研究,并从中发现了一些化学小分子体 内作用的疾病相关新靶点。 2,可逆探针 由于不可逆探针的设计受到对蛋白质(酶)活性中心结构信息、小 分子化合物对酶抑制部位信息等缺乏的局限性,人们希望直接用可 逆抑制剂作为化学探针,这种方法有望扩展于针对所有靶蛋白质的 功能蛋白质组研究,并可用于新药筛选。 3,无标记探针 ABPP实验一直是在细胞或组织匀浆液中进行的,一个主要的原因 是报告基团体积很大(分子量通常在700一10o0Da),限制了探针分 子的吸收、分布,甚至可能改变探针分子的作用模式)。 近年来, ABPP 实验引入了click-chemistry,发展了没有标签 (tag-free)的探针分子,报告基团(荧光素或生物素)是在探针分 子共价标记了靶蛋白后,通过 Huisgen 1,3- 偶极环加成反应(炔 基与叠氮基反应形成稳定的三氮唑结构)连接到探针分子上。 Sharpless 等发现在 Cu(I)催化下炔基与叠氮基可以在温和的条 件下高产率得到三氮唑,这一发现使得click-chemistry可以有效 地运用到功能蛋白质组学的研究。 无标记探针分子的设计需要运用光亲和标记技术,引入光亲合标记基 团(photoaffinity labeling group),其作用是在探针分子与靶蛋白 结合(可逆)后,通过光解作用在探针分子与靶蛋白之间引入共价键。 通常这类探针分子包括活性部位(activity unit)、光亲合标记基团 、连接部位及报告基团。 光亲和标记探针分子的光亲和基团有:苯基叠氮类 (phenyl azides)、trifluor
收藏 下载该资源
网站客服QQ:2055934822
金锄头文库版权所有
经营许可证:蜀ICP备13022795号 | 川公网安备 51140202000112号