第五节第五节 化学蛋白质组学化学蛋白质组学 人类基因组计划的顺利实施，使生命科学研究的重心逐渐转移到对生物 功能的整体研究上。对生物功能的主要体现者或执行者-蛋白质的表达 模式和功能模式的研究必然成为生命科学发展的趋势。 在20世纪90年代中期，国际上萌发了一门研究 细胞内各种蛋白质的组成及其活动规律的新兴 学科-蛋白质组学(proteomics)。 蛋白质组(proteome)这一概念是1995年由澳大 利亚学者最先提出来的，源于蛋白质（ protein）与 基因组（genome）两个词的杂合 ，指的在一个特定的时间和空间内，一个基因 组一种细胞组织或一种生物体所表达的全部 蛋白质。 对蛋白质组问题的研究称之为蛋白质组学 (proteomics)，主要是在整体水平上研究细胞 内蛋白质的组成及其活动规律。 而化学在这里再一次与生物学的最新发展融合，形成新的 交叉研究领域-化学蛋白质组学(chemical proteomics)。 化学蛋白质组学是一个目前仍在不断扩展中的全新领域， 学术界至今对其尚未有确切定义。一定程度上，化学蛋白 质组学可以理解为“化学加蛋白质组学”。 具体地说，由于大多数蛋白质的功能直接依赖于小分子配 体与靶蛋白的结合步骤，因此，利用能够与靶蛋白质特异 作用的化学小分子来扰动和探测蛋白质组，有可能在蛋白 质组的整体水平上，揭示感兴趣的特定蛋白质的功能以及 它们与化学小分子的相互作用 化学蛋白质组学利用化学小分子直接从功能角度切入蛋白 质组的研究，有别于以往的主要以蛋白质定性定量鉴定为 基础的蛋白质组学技术，因此，被认为是很有前途的新一 代功能蛋白质组学技术(function-based proteomics)。 一，化学蛋白质组学的研究方法 蛋白质组学从整体上对体系内蛋白质进行研究 ，常见3种研究模式： 第1种是检测蛋白质组理化参数的“完全蛋白质 组学”； 第2种是差异蛋白质组学，主要通过比较分析不 同状态下蛋白质表达图谱，实现对体系内代谢 调控的动态监测，从而更易于揭示机体对内外 界环境变化产生反应的本质规律； 第3种主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白 质的功能及蛋白质间的相互作用。 化学蛋白质组学的主要任务在于，发展和应用具 有生物活性的靶向探针，用于复杂的蛋白质组中 的特异性酶或蛋白质家族的功能研究。小分子与 细胞内靶蛋白质的相互作用，是很多蛋白质生物 功能的基础。这种相互作用强弱不一，既可以是 可逆的，也可以是不可逆的；可以是单靶点的， 也可以是同时作用于多个靶蛋白的。 生物体(细胞 组织等)蛋白质组的所有蛋白质经化 学小分子处理前后的差异蛋白质组展示(proteome profiling)，可以用来研究这种相互作用。对化 学学科而言，通过功能蛋白质组学的研究服务于 人类的健康，促进分子医学的发展，如寻找先导 药物以及药物的靶分子是其重要的目标。 （一）蛋白质组学的基本技术流程 目前，蛋白质组 学研究通常有三 个步骤：第一， 运用双向电泳技 术分离样品中的 蛋白质；第二， 应用质谱技术鉴 定通过双向电泳 分离出来的蛋白 质；第三，应用 生物信息学技术 存储、处理、比 较获得的数据。 1，双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 1975年Ofarrell和Klose首先在两个实验室分别建立了 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2-DE电泳)， 其基本原理是利用不同蛋白质具有不同等电点(pI)和不 同分子量大小的特点将它们分离。 他们将高分辨率的等电聚集电泳(isoelectrofocusing， IEF)和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)联合组成双 向电泳，第一向为IEF，采用经典的两性电解质载体在 电流作用下形成pH梯度，依据pI的不同进行分离；第二 向利用SDS-PAGE根据分子量大小进行分离。 2，基质辅助激光解吸电离-飞行 时间质谱技术 基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱测量法以 多肽质量/电荷比为依据同数据库资料进行比较, 进而对蛋白质进行鉴定。此法通常被称为肽质量 指纹法。 3，色谱与质谱联用技术 将色谱技术与新型质谱技术相结合,可有效地克服双向 凝胶电泳/质谱的不足,确保了分析的准确性。 首先对蛋白质混合物进行酶切得到混合肽段,然后通过 强离子交换反相色谱柱进行多次分离,并连用液相色谱- 串联质谱分析肽段,而且通过核素标记肽段的技术实现 蛋白定量分析。分离后的产品离子得到完好地扫描,连 用分析肽段,可以区分待测蛋白质和其他类似物。 4，信息查询 生物信息学(Bioinformatics)是生物与计算机 以及应用数学相互结合而形成的一门新兴学科 。它通过对生物学实验数据的获取、加工、存 储、检索与分析,达到解释数据所蕴含的生物 学意义的目的。 蛋白质组学研究任一物种的基因组编码的全套 蛋白质,它通常是高通量的,在进行蛋白质功能 预测和结构分析时,生物信息学就成为蛋白质 组学研究的核心技术之一。 常用几种软件进行分析。 PeptIdent是以肽质量指纹谱数据鉴定蛋白质的查询软 件,是将数据库中的所有蛋白质用我们选定的酶进行“理 论消化”形成肽片段,计算其理论肽段质量,建立索引,然 后再与输入的实验数据进行对比,按实验数据匹配数的 多少排列并输出匹配结果。蛋白质的等电点、分子量和 种属可以详细限制候选蛋白,减少假阳性误差。 MS-Fit和Mascot软件利用了MOWSE得分法,特别考虑数据 库中肽段分布频率的问题。Mascot软件还把MOWSE得分 转换为绝对概率,减少结果的不确定性。 蛋白质组学相关网站 http:/www.proteomeworks.bio- 蛋白质组研究技 术、信息等。 从新药开发角度，发现 新蛋白及新作用。 http:/www.proteome.med.umich.edu 可以找到蛋白质组 研究相关企业、各 种仪器来源、新闻等。 http:/www.proteome.co.uk 各种蛋白质组研究相关信息 http:/www.micromass.co.uk 介绍蛋白质鉴定的先进仪器 http:/www.expasy.ch 蛋白质鉴定专家系统，Swiss Institute of Bioinformatics http:/expasy.proteome.org.au 蛋白质鉴定专家系统， Australian Proteome Analysis Facility http:/expasy.cbr.nrc.ca 蛋白质鉴定专家系统，Canadian Bioinformatics Resours 二、功能蛋白质组学技术 功能蛋白质组学主要是研究蛋白质功能、蛋白质蛋白质 相互作用、蛋白质小分子相互作用，其方法主要有蛋白 质阵列技术(protein arrays)、噬菌体展示技术(phage display)、基因芯片技术(cDNA micr-oarray)、酵母双杂 交技术等。 而通过筛选小分子配体来描述新蛋白的功能，是化学蛋白 质组学的主要研究内容，化学蛋白质组筛选也将提供新药 开发的先导化合物。共价结合于目标蛋白质、便于纯化和 鉴定的化学探针，无疑是该领域最为重要的工具。可利用 化学探针在纯化的蛋白质、细胞裂解物、活细胞和活动物 等不同水平，评价药物作用强度和选择性。一方面，可鉴 别与不同疾病相关的新型药物靶点；另一方面可用于药物 先导化合物的快速鉴定，从而加快候选化合物应用于临床 的进程。其中基于靶酶活性的特异化学小分子探针 (activity-based probes，ABPs)是一种新的化学蛋白质组 学研究技术。 activity-based probes，ABPs 该技术的原理是：合成同时带有反应基团和标签基团的 ABPs试剂与待研究的蛋白质组作用(ABPs中的反应基团 能够特异性共价修饰蛋白质组中的某类酶蛋白而将化学 小分子“挂”到感兴趣的靶酶上，然后，利用ABPs中的荧 光或生物素标签基团又可将这些靶酶一个个地从蛋白质 组中“钓”出来)。由于ABPs是针对待研究靶酶的活性而 定向设计的化学小分子，因而能够直接检测蛋白质组中 感兴趣的靶酶的活性。 ABP 的分子量通常在 700-1000 D，这主要是由于报告 基团(荧光基团或生物素)造成的，这些报告基团还可能 改变活性分子在体内的性质及其与靶蛋白的作用模式， 并因此限制了ABP分子在体内细胞的吸收与分布。ABPP 实验一般都是在体外进行的，如细胞或组织匀浆液，这 种实验方式可能会改变细胞或组织内活性酶或非活性酶 的浓度及它们各自的亚细胞分布。因此，体外的功能蛋 白质组学研究只能大致地揭示活细胞或动物体内组织中 蛋白质的功能状态。 1，不可逆探针 就其主要基础性结构而言，不可逆的化学探针具有三种特 异的功能部位：与酶共价交联的反应基团，调节反应基团 反应特异性的链接区和一个便于鉴别和纯化目标酶的标记 物。 （1）反应基团 反应基团为靶蛋白质提供必要的共价修饰，其选择性的高 低是化学探针设计过程中的最大的挑战 其难度在于功能基 团的二元性，一方面具有特定蛋白质中氨基酸残基的反应 性，另一方面不识别细胞或细胞抽提物的其他活性片段。 （2）链接区 通常采用长链烷或聚乙二醇作为化学探针的链接区，连接 反应基团和标记物。主要在反应基团和标记物之间提供足 够的空间以阻止空间障碍的形成，便于反应基团与酶的结 合以及对结合物的纯化。烷基链可调节探针的疏水性，使 其便于进入活细胞和组织；而聚乙二醇链可提高疏水探针 的溶解性，便于进入水溶液。 （3）标记物 一般选用生物 素、荧光物质 和放射性物质 作为化学探针 的标记物，可 快速鉴别和纯 化探针所修饰 的蛋白质。蛋 白质凝胶电泳 是最简单有效 的蛋白质分离 方法，因此用 于标记探针的 物质应兼容于 SDS-PAGE法。 目前,该方法已成功地分别用于针对丝氨酸蛋白酶，巯基蛋白酶，去泛 蛋白化酶等靶酶的功能蛋白质组研究,并从中发现了一些化学小分子体 内作用的疾病相关新靶点。 2，可逆探针 由于不可逆探针的设计受到对蛋白质（酶）活性中心结构信息、小 分子化合物对酶抑制部位信息等缺乏的局限性，人们希望直接用可 逆抑制剂作为化学探针，这种方法有望扩展于针对所有靶蛋白质的 功能蛋白质组研究，并可用于新药筛选。 3，无标记探针 ABPP实验一直是在细胞或组织匀浆液中进行的，一个主要的原因 是报告基团体积很大(分子量通常在700一10o0Da)，限制了探针分 子的吸收、分布，甚至可能改变探针分子的作用模式)。 近年来， ABPP 实验引入了click-chemistry，发展了没有标签 (tag-free)的探针分子，报告基团(荧光素或生物素)是在探针分 子共价标记了靶蛋白后，通过 Huisgen 1,3- 偶极环加成反应(炔 基与叠氮基反应形成稳定的三氮唑结构)连接到探针分子上。 Sharpless 等发现在 Cu(I)催化下炔基与叠氮基可以在温和的条 件下高产率得到三氮唑，这一发现使得click-chemistry可以有效 地运用到功能蛋白质组学的研究。 无标记探针分子的设计需要运用光亲和标记技术，引入光亲合标记基 团(photoaffinity labeling group)，其作用是在探针分子与靶蛋白 结合(可逆)后，通过光解作用在探针分子与靶蛋白之间引入共价键。 通常这类探针分子包括活性部位(activity unit)、光亲合标记基团 、连接部位及报告基团。 光亲和标记探针分子的光亲和基团有：苯基叠氮类 (phenyl azides)、trifluor