第九章 克隆基因的表达 人粒细胞集 落刺激因子 Lac启动子 遗传信息从 DNA到蛋白质 的传递过程 中心法则（ central dogma ）。 一、基因表达： 二、克隆基因的表达： 外源基因在宿主细胞中表达。 外源基因 表达载体 重组载体 导入宿主细胞 在宿主细胞中 表达出蛋白质 提取蛋白 宿主细胞： 原核细胞或真核细胞。 用原核生物作宿主。 A dividing E. coli 第一节 外源基因在原核细胞中的表达 原核或噬菌体启动子MCSSD序列终止子 识别原核细胞的启动子，催化所有的 RNA合成。 数个相关的结构基因与其调控区结合形 成一个表达的协同单位。 一、原核生物基因表达的特点 2. 以操纵子为单位 1. 只有一种RNA多聚酶 有意义链 5 反意义链3 转录 mRNA5 3 翻译 蛋白质NC 5 3 3. 转录和翻译偶联、连续进行。 4. 不含内含子，缺乏转录后的加工系统。 5. 调控主要在转录水平上。 原核生物中起始密码子AUG上游712个核 苷酸序列因其与16SrRNA 3末端反向互补 而被认为在核糖体-mRNA的结合过程中起 作用，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。 6. mRNA具有核糖体结合位点SD序列 Shine-Dalgarno（S-D）sequence: 二、原核表达系统的注意事项 1. 外源基因不能带有内含子。 2. 真核生物不能用基因组DNA ，必须用cDNA 。 3. 必须利用原核细胞的调控元件（启动子等） 4. 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。 是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始 mRNA合成的序列。 大肠肠杆菌的所有启动动子中都有两段一致 顺顺序（consensus sequence）。 三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 -35 Box 和 -10 Box （1） 启动子序列 consensus sequences 5-TTGACA-3 5-TATAAT-3 -10box（Pribnow Box） TTGACA TATAAT 转录起始位点 17bp 5 核糖体结合位点 RNA聚合酶 亚基的识别位点 。 -35box 原核启动子共有序列的相对位置 （2）翻译的起始位点 核糖体结合位点（ RBS） 1）Shine-Dalgarno（SD） sequence： mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。 ribosome binding site SD mRNA 5AGGAGGUAUG 16S rRNA3 UCCUCCA S-D序列距离AUG的距离也影响翻译 AUG（91%） GUG（8%） UUG（1%） 位于SD序列下游。 ii）起始密码： 全酶是一个5聚体，含有两个小亚亚基，和2 两个大亚亚基（和），一个亚亚基。 2. RNA多聚酶 大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录 tRNA，rRNA和mRNA。 （1）结构 3. 转录终止子 内终止子 intrinsic terminator： E.coli中促使转录终止的DNA位置有 一段反向回文顺序，其后紧接一串A ，称为内终止子，形成终止信号。 在表达载体克隆位点的下游一般设计一 段转录终止子。 启动子操纵子S-D序列目的基因终止子 由于茎环3段紧接一串A/U的配对，稳定性 比较差，有利于转录物脱落而不利于转录 延续。 原因： 反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎 环结构，使转录物与模板之间配对的碱基 数降低，整个减弱了RNA 与DNA的互作 茎环结构 多聚A/U 5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-3 3-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板) 转录 5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA) RNA折叠 mRNA折叠 U C C U G GC AU CG CG GC CG CG GC A A CCCAC UUUU3 DNA RNA聚合酶 脱落 大肠杆菌偏爱UAA。一般安置上全部的三个 终止密码UAA，UAG，UGA，防止核糖体跳 跃（skipping）。 4. 翻译终止密码 5. 翻译增强子 Translation enhancer 能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞 中的表达效率的特殊序列。 T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）; 大肠杆菌atpE基因mRNA5-UTR（非翻译区）中富含 U的区段。 必须是一种强启动子 能使外源基因的蛋白产量达到细胞 总蛋白的10%-30%以上。 应呈现低水平的基础转录 便于表达毒性蛋白等。 应是可诱导型的 用温度或化学试剂诱导。 （1）最佳启动子必须具备的条件 6. 基因工程常用的原核启动子 来自大肠杆菌的 乳糖操纵子。 用乳糖或其类似 物IPTG充当诱导 物，与阻遏蛋白 结合，解除抑制 。 Plac O目的基因 （2） 乳糖启动子lac 阻遏物与操纵基因结合阻遏物与操纵基因结合 四聚体的 阻遏物 单体的阻遏物 阻遏物与DNA的结合 乳糖操纵子控制区的结构 阻遏物作用区 CAP作用区 cAMP +CRP= CAP RNA聚合酶作用区 组成： 长度： 205bp的HaeIII片段 （包括-半乳糖苷酶的前8个密码）。 环腺苷酸（cAMP）受体蛋白CRP（cAMP receptor protein），cAMP与CRP结合后所形成的复合物称 激活蛋白CAP（cAMPactivated protein ）。当大肠 杆菌生长在缺乏葡萄糖的培养基中时，CAP合成量 增加，CAP具有激活乳糖（Lac）等启动子的功能。 一些依赖于CRP的启动子缺乏一般启动子所具有的 典型的-35区序列特征（TTGACA）。因此RNA聚合 酶难以与其结合。 CAP的功能：显著提高酶与启动子结合常数： CAP通过改变启动子的构象以及与酶的相互作用 帮助酶分子正确定向，以便与-10区结合，起到取代- 35区功能的作用。 CAP还能抑制RNA聚合酶与DNA中其它位点的结 合，从而提高与其特定启动子结合的概率。 IPTG有毒、昂贵 Sigma 636.00元 /g IPTG =异丙基硫 代-D半乳糖 人粒细胞集 落刺激因子 人粒细胞集 落刺激因子 重组大肠杆菌染色体 （3）色氨酸启动子trp trpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpB trpA trpR阻遏蛋白基因； P1 P2 启动子； O 操纵基因； 衰减子 来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。 色氨酸操纵子 色氨酸合成相关基因5个，编码3种酶。 trpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpB trpA 邻氨基苯甲 酸合成酶 吲哚甘油 硼酸合成酶 色氨酸 合成酶 链 链 分支酸 邻氨基 苯甲酸 磷酸核糖基 邻氨基苯甲酸 CDRP 吲哚甘 油-磷酸 色氨酸 阻遏物 转录 （P1是主要启动子，P2的作用只有3%。） 没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因 结合，能转录合成色氨酸所需要的酶。 苯氨基磷酸脱氧核酮糖 trpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpB trpA 阻遏物 色氨酸 结合 不转录 用于表达载体的trp启动子一般还附带操纵基因 、和部分trpE基因。 P1OtrpE目的基因 有色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸结合后才能与 操纵基因结合，从而阻止色氨酸合成酶类的转 录。 （色氨酸称为corepressor辅阻遏物） （4）PL和PR启动子 是从噬菌体中得到的一类启动子，比lac启动 子的活性高8-10倍，比trp启动子活性高。 cIII NPL/OLcI PMOR/PRCro PEcII N:抗终止蛋白； Cro: 抗阻遏蛋白(裂解必需的）； cI, cII, cIII: 阻遏蛋白； P:启动子；O:操纵子。 R:右；L:左 cIII N PL/OLcI PMOR/PRCro PEcII 阻遏物 转录 转录 转录 当cI合成后，与OL和OR结合阻止RNA聚合 酶，则左右基因都受到抑制。但促进PM使 cI进一步转录。进入溶原期。 早期左边 早期右边 cI857: 表达载体常用的噬菌体启动子是PL。 调节基因cI 则是选择了一个温度敏感性的 突变基因cI857。 整合在宿主基因组里，或克隆到载体上。 44-45oC时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录 cI857cI857PL外源基因 32oC时阻遏PL，外源基因不转录。 四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位 1. 细胞质中表达 （1）包涵体（inclusion body） 是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白 质聚集折叠而成的晶体结构物。 形成原理未知。 在大肠杆菌细胞内表达人生长激素（在大肠杆菌细胞内表达人生长激素（ h human uman g growth rowth h hormone, ormone, hGHhGH）。）。 例： 使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、 不损害寄主细胞 回收的蛋白生物活性差。 缺点 优点 2. 周质中表达 （1）周质（periplasm） 格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间 的细胞结构部分。 蛋白质从细胞质转运到周质的复杂 机理目前不完全清楚 优点： 容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠 、被降解的少。 phoA、OmpA、OmpT、OmpF、 LamB、-内酰酰胺酶（lactamase）、 肠肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等 （3）常用的原核信号肽 大肠杆菌的信号肽： 能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需 要正确切割掉。 （2）信号肽（signal peptide） 一般位于N端。 鼠源RNase、人生长激素信号肽。 也能在细菌中起作用。 （2）真核信号肽 胡萝卜欧氏杆菌的PelB蛋白。 金黄色葡萄球菌的蛋白A。 枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶 （endoglucanase）。 由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分 泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不 太理想。 用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性 融合蛋白；溶血素(hemolysin)是一种可使红血球细胞溶解的毒 素(cytolytic toxin)。在许多病原菌被证明与致病相关。 使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分 泌到细胞外的培养基中。 3. 胞外表达 或与细菌素释放蛋白（bacteriocin release protein)共表达。 载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的 任何蛋白质融合在一起。 S-D序列 ATG-外源基因-TAG 优点 五、几种类型的原核表达载体 1. 非融合型表达载体 产物结构接近于真核细胞体内的蛋 白质结构。 缺点： 容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。 哈佛大学的Gilbert实验室建立的。 表达能力强。 （1）pKK223-3 载体 组成结构： 强启动子: tac（trp-lac）: trp的-35区lacUV5的-10区 lac操纵基因 操纵基因： 乳糖操纵子系统。 终止子： 调节基因： Lac I 宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。 如JM105菌。 rrnB（rRNA操纵子的强终止子） S-D插入位点区 S-D序列和插入位点区： tac PLac O S-D 插入位点区rrnB T 宿主lac I 载体的其余部分： 来自pBR322质粒。 表达诱导物： IPTG（乳糖的类似物，不会被降解） 阻遏物IPTG 必须选择一个有 lacI的宿主菌。