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原 创 性 声 明 原 创 性 声 明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导 F ,独立进行研究工 作所取得的成果。 除文中己 经注明引用的内 容外, 本论文不包含任何其他个人或集体 已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文 中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者 ( 需亲笔)签名: 5v 4 初砰年 月, 2 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。 本人 授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索, 可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口, 在_ 年解密后适用本授权书。 本学位论文属于不保密口。 ( 请在以_ 卜 方框内打 “J ) 学位论文作者 ( 需亲笔)签名: 导师 ( 需亲笔)签名: x t j 万 衅 年 , 月, L q 年月日 中 文 摘 要 河南省肉牛规模化养殖场牛病毒性腹泻 的诊断与防制技术研究 摘 要 牛病 毒性腹泻( B o v i n e v i r a l d i a r r h e a , B V D) 是由牛病毒性腹泻病 毒( B o v i n e v i r a l d i a r r h e a v i r u s , B V D V) 引 起的,主要侵害牛、羊、鹿、耗牛、 猪等动物的一种重要的 传染病, 临床主要表现为 发热、 秘膜糜烂、 溃疡、白细 胞减少、 腹泻、 咳 嗽及怀孕母 牛流产或崎形胎儿。 世界每年死于B V D V感染的牛不少于5 0 0 万头, 占 牛饲养总数的 。 .5 %一 1 % 。随着我国养牛业的 迅速发展,国 外品种不断引进, 该病在我国 发生、流 行呈上升趋势。 早在2 0 世纪6 0 年代, 我国的云南、山东、四川等地就有类似该病发 生。目 前, 该病 在河南也普遍存在。为找到一种快速诊断B V D的方法, 有效地控制 其蔓延,做好防制工作,减少B V D对河南省肉牛业造成的损失,本论文从以下几个 方面进行了 研究: 1 、河南 省牛病毒性腹泻流行病学 调查 从河南 省唐河、内乡 等巧个县市的不同牛 群随即采集 血样6 7 1 份, 从养牛业比 较发达的南阳、周口、 安阳3 市部分规模化肉 牛场随机采集6 4 5 份血样, 分别用牛病 毒性腹泻杭体和抗原E L I S A试剂盒检测,结果 表明:6 7 1 份血样中,1 5 4 份为抗体阳 性,阳 性率为2 2 . 9 5 % ; 6 4 5 份血样中1 0 0 份为B V D V阳性, 其检出率为1 5 . 5 0 ,从 而 证实B V D在河南省广泛存在. 2 、河南 省牛病毒性腹泻病毒地方 株的分离 及鉴定 从河南省不同地区 规模化肉 牛场B V D疑似病例中采集病料, 将处理好的病料接 种M D B K细 胞, 并盲传四 代,分离 得到两 株可产生细 胞病变的病 毒, 经电 镜观察、 理化特性鉴定、 琼脂扩散试验和中 和试验, 确定两 株病毒均为B V D V , 分别将其命名 为H N - 1 株和H N - 2 株。动物回归试验进一步证实了 所分离的两株病毒均为B V D V , 3 、 分泌杭牛病毒性腹泻病毒单克隆杭体杂交瘤细 胞株的建立与鉴定 在M D B K细 胞上增殖B V D V H N - 1 株, 用蔗糖密 度梯度离 心法纯化病毒, 然后免 疫B A L B / c 小鼠。 应用单克隆抗体技术, 制备脾细胞并与N S 。 骨髓瘤细 胞融 合。 经间 接E L I S A筛 选, 用有限 稀释法亚克隆, 得到4 株能 分泌B V D V单克隆杭体的杂交 瘤 细 胞 株: 3 A 8 . 3 C 7 , 3 C , 1 - 3 F 9 。 经 鉴 定, 3 A g . 3 C 7 . 3 E 9 株分 泌的 单 克 隆 抗 体为I g G l 亚类, 3 C , : 株为I g G 2 a 亚类。 杂交 瘤细 胞的平均染色 体数目 为9 9 条. 3 A 8 . 3 C 7 , 3 C 株分泌的抗体与C S F V , B D V发生交 又 反应, 与B C V , B R V无交又反应,而3 C , 1 株 河南省肉牛规模化养m场病毒性腹i = i 病的诊断与肪制技术研究 分泌的杭体与以上四 种病毒均不发生交叉反应, 显示出 较好的特异性。 这些单克隆 杭 体的获得为B V D的 研究及诊断方法的建立莫定了 基础。 4 、 牛病毒性腹泻病毒单克隆杭体双夹心E L I S A的建立及其应用 用3 C , ; 株, 按常 规方法 制备腹水、 提纯I g G , 与已 制 备的兔抗B V D V I g G 建立了 检测B V D V的单克隆杭体双夹心E L I S A 。 该方法与病 毒分离 试验对比,阳 性符合率 为8 6 .6 7 %,阴 性符合率为1 0 0 %; 与中 和试验对比,阳性符合率为9 3 犯%, 阴性符合 率为1 0 0 % 。 该方法 最 低病 毒检出 量为2 0 0 n g l m l 。 用 该方法与商品 化E L I S A试剂 盒同 时对比 检测牛全血 1 0 0 份, 二者阳胜 检出 符合率为% 1 5 %。初步应用该方法 对河南 省南阳、 周口、 安阳3 市肉牛场的5 6 2 头份牛全血的检测结果表明, 牛群B V D V的感 染率为1 7 .0 8 % 。 该方法具有良 好的特异性、 敏感性及稳定性, 能够较好地用于B V D V 的监测,具有良 好的应用前景。 5 , 牛病毒性腹泻囊素油乳别灭活疫苗的 研制 将B V D V H N - 1 株在M D B K细 胞上 增殖、 浓 缩、 灭 活, 并与 免疫增强 剂一 一囊 素 共同乳化研制出B V D囊素油乳剂苗。 对其物理性状、安全性、 保存期等 进行 检测, 初步应用该疫苗进行免疫试验, 并和常规灭活苗以及弱毒苗进行免疫效果比 较。 试验 结果 表明: 该疫苗合格、 安全, 保存期达 到 1 2个月;产生的杭体水平较高 且维持时 间长,免疫效果和保护率优于常规灭活苗 和弱毒苗。 、肉 牛 规模化养技场病 毒性腹泻防 制 措施的 制定及实 施效果分 析 根据B V D流行病学 特征, 结 合本研究成果, 从品种选育、 饲养管理、 饲料营 养、 环境调控、 免疫预防、 兽医 卫生等方面制定了一套B V I ) 防制措施 并在河南的南阳、 周口、 安阳3 市部分肉牛场进行了实 施,实 施效果表明:试验牛场B V D感染 率、 发 病率、 牛场整体病死率均有所下降, 在一定程度上控制了 该病的流行和传播, 提高了 肉 牛的生产性能, 取得了 显著的经济效益和社会效益。 关健词:牛病 毒 性 腹泻; 牛 病 毒 性 腹泻 病 毒; 流 行 病 学 ; 分离 鉴定; 单 克隆 杭 体; 双杭夹心E L I S A ;囊素油乳剂苗;防制措施 英 文 摘 要 R e s e a r c h o n D i a g n o s i s a n d C o n t ro l o f B o v i n e V ir a l D i a r r h e a i n t h e I n t e n s i v e B e e f F a r ms i n He n a n P r o v i n c e Ab s t r a c t B o v in e v i r a l d i a r r h e a ( B V D ) i s o n e o f t h e k e y i n f e c t i o u s d i s e a s e s c a u s e d b y b o v in e v i r a l d i a r r h e a v ir u s ( B V D 码, w h i c h m a i n l y i n f e c t s c a t t l e , s h e e p , d e e r , s w in e , e t c . I t s c l i n ic a l s y m p t o m s a r e c h a r a c t e r i z c d b y f e v e r , m u c o u s m e m b r a n e e r o s i o n , u l c e r , l e u c o p o e n i a , d i a r r h e a , c o u g h , a b o r t i o n o r c o n g e n i t a ll y d e f o r m e d b a b i e s . E v e r y y e a r t h e n u m b e r o f c a t t l e d y i n g o f B V D i s n o l e s s t h a n S m i l l i o n i n t h e w o r l d , a c c o u n t i n g f o r 0 .5 - - 1 % o f t h e t o t a l n u m b e r o f c a tt l e . Wi t h t h e q u i c k d e v e l o p m e n t o f c a tt l e i n d u s t r y a n d t h e i n t r o d u c t i o n o f f o r e i g n c a tt l e b re e d s , t h e o c c u r r e n c e a n d s p re a d o f B V D a r e a l s o i n c r e a s i n g i n C h i n a . A s e a r ly a s 1 9 6 0 s , t h e d i s e a s e w a s f o u n d in a r e a s s u c h a s Y u n n a n , S h a n d o n g , a n d S i c h u a n P ro v in c e in C h i n a . I t a l s o e m e r g e s i n H e n a n P r o v i n c e a t p re s e n t . I n o r d e r t o s e t u p a s p e c i f i c a n d s e n s it i v e d i a g n o s i s as s a y , c o n t ro l i t s s p re a d in g a n d d e c r e a s e t h e l o s s , r e s e a r c h e s h a v e b e e n m a d e o n t h e f o l l o w i n g as p e c t s i n t h e t h e s i s : 1 . R e s e a r c h o n E p i d e m i o l o g y o f B V D i n H e n a n P r o v i n c e 6 7 1 b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d r a n d o m l y f r o m c a t t l e f a r m s o f 1 5 c o u n t i e
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