誊；! 蠹 | 要氡蔓基酸籍“受重量 谷氨酸发酵途径分析及 代谢改造策略 陈宁刘辉谢希贤 天津科技大学生物工程学院 途径分析( p a t h w a ya n a l y s i s ) 是代谢工程中用 以指导遗传操作的理论基础，是代谢网络分析的重 要方法之一。这些反应模型可由凸分析确定，由计 算机算得。若以向量e 来代表一个基本反应模型， 则所有可能代谢流的向量Y 可定义为这些模型的 非线性组合：y - a ie i ( a i 芝O ) 。实际上细胞内 代谢网络就是由基本反应模型的非负线性组合产 生的。在这些基本反应模型中有一个代表最高的产 率和代谢流分布的理想载流途径。理想载流途径的 构建开始于酶的确定、理论产率的计算和确定最优 的代谢流分布，因此途径分析对于目的产物理想载 流途径的构建具有重要意义。 谷氨酸棒杆菌广泛应用于多种氨基酸的工业 生产，如谷氨酸、赖氨酸等。作为代谢工程的一个 极具前景的理论，途径分析研究对于指导谷氨酸棒 杆菌发酵生产谷氨酸的菌种选育及过程控制具有 重要意义。提高菌种产酸水平的传统方法是切断支 路代谢，解除反馈抑制。现代的重组D N A 技术同 样偏重于合成支路的改造，比如限速酶的过量表 达。这些方式常常很难达到预期的目的。因为过多 地偏重于终端支路代谢的操作，而忽略了中心代谢 途径导向支路代谢的能力。因此有必要采用计算机 辅助计算，对谷氨酸棒杆菌的L _ 谷氨酸合成的整个 代谢网络进行途径分析，从而指导代谢工程的操 作。基元模型分析是途径分析的重要工具之一。应 用基元模型分析可以确定最大理论产率模型，找到 目的产物合成的最优途径等。目前已有许多基元模 型分析成功应用的实例，如酿酒酵母合成聚一p 羟丁 酸，大肠杆菌合成芳香族氨基酸等。 一、L 谷氨酸合成代谢网络分析 考虑副产物乳酸和丙氨酸，建立L 广谷氨酸合成 代谢网络，其化学方程式如下： R 1 ：G l c + P E P = G 6 P + P y r R 2 ： G 6 P = F 6 P R 3 ：F 6 P + A T P = 2 G A P + A D P R 4 ：G A P + N A D + A D P = P E P + N A D H + A T P 4 - H 2 0 R 5 ：P E P 4 - A D P = A T P + P y r R 6 ：P y r + C o A4 - N A D = A c C o A + C 0 2 + N A D H R 7 ：G 6 P + H 2 0 + 2 N A D P = R I B U 5 P + C 0 2 + 2 N A D P H R 8 ：R I B U 5 P = X Y L 5 P R 9 ：R m U 5 P = R I B 5 P 5 7 2 0 0 7 年全国发酵行业高峰论坛 R I O ：X Y L S P 4 - R I B 5 P = S E D 7 P 4 - G A P 采用基元模型分析方法对谷氨酸棒杆菌合成 R l l ：X Y L 5 P + E 4 P = F 6 P + G A P L - 谷氨酸进行途径分析，确定L 谷氨酸的最大理论 R 1 2 ； G A P + S E D T P = F 6 P + E 4 P 摩尔产率为1 0 0 。基元模型如下： R 1 3 ：A c C o A 4 - 0 A A = C o A + C I T 1 、G l c + N H 3 + 1 5 0 2 + 7 A D P = 2 H 2 04 - C 0 2 + R 1 4 ：C I T = I C I G l u + 7 A I P R 1 5 ： I C I + H 2 04 - N A D P = K G4 - C 0 2 +2 、G l c + 2 A D P = 2 H 2 0 + 2 L a c4 - 2 A T P N A D P H 3 、1 1 6 6 6 7G l c4 - 2N H 3 + 0 2 + 6A D P = 3H 2 0 R 1 6 ：K G + C o A + N A D = S U C C o A 4 - C 0 2 4 - + C 0 2 + 2 A l a4 - 6 A T P NADH4、15G l c + N H 34 - 4 50 2 + 2 0A D P = H 2 0 + 4 R 1 7 ：S U C C o A + A D P = S U C - 4 - C o A + A I P C 0 2 + G l u + 1 9 5 A T P R 1 8 ：S U C + F A D = F u m + F A D H 2 5 、G l c + N H 3 + 30 2 + 1 4A D P = H z 0 + 3C 0 2 + R 1 9 ：F u m = M A I A 1 a + 1 3 5 盯P R 2 0 ：M A L + H 2 0 + N A D = O A A4 - N A D H 由上述模型可知，谷氨酸合成的碳架损失主要 R 2 1 ：I C I = S U C + G L Y O X Y 在于C 0 2 和副产物的生成。由模型1 和2 线性组合 R 2 2 ：A c C o A + G L Y O X Y = C o A + M A L 生成方程式：1 5G l c4 - N H 3 + 1 50 2 + 9A D P = 4 R23：PEP+C02=OAAH20+C02+9A T P + L a c + G l u 。生成l m o l 乳酸， R 2 4 ：N H 3 + K G + N A D P H = G l u + H 2 04 -消耗0 5 m o l 葡萄糖，谷氨酸的摩尔产率就会下降到 N A D P 6 6 7 。 R 2 5 ：l y r + N A D H = L a c + N A D 生成谷氨酸的最大理论模型l 对应的最优代谢 R 2 6 ：P ”+ G l u = A l a + K G 途径为：R 1 = 0 5 ，R 6 - - O 5 ，R 1 3 - - 0 5 ，R 1 5 - - - 0 5 ， R 2 7 ：4A D P + 2N A D H - I - 0 2 = 4A r P + 2R 2 3 = O 5 ，R 2 4 - - 0 5 ，R 2 7 = 0 7 5 ，R 2 = 0 5 ，R 3 - - O 5 ， N A D R 4 = l ，R 1 4 - - O 5 。如下图所示： R 2 8 ；2 A D P + 2 F A D H 2 + 0 2 = A T P + 2 F A D 5 8 二、谷氨酸生产菌代谢改造思路 依据途径分析获得的谷氨酸合成的最优代谢 途径，进一步确定谷氨酸生产菌改造思路如下： 1 强化谷氨酸合成代谢途径 确立L 谷氨酸代谢途径相关的合成酶类，现对 其代谢途径、涉及的相关酶和工程菌株构建策略简 要叙述如下： 2 0 0 7 年全亘发酵行业高峰论坛 V - - 6 - 0 1 1 c A 7 ) 儿 矗1 C = = = ：* # t ”聊1 m Uf J ， 骧：= 一：= 根据代谢T 程原蝉，参照脊氢酸棒打消中L 一 谷氨酸的生物代谢建张及代谢调节机制，L - 谷氨酸 = 程菌构建荒略如下： 1j 构建- 酮戊二酸脱氢酶k 旦d 摹目缺失或定 点修饰的突变株 从谷氨酸生物合成的代诳逢径可以看出，减弱 q 一酮戊= 酸脱氢酶复台件的活性u J 以使代谢流叫 备鲺酸迁移从而使备氢酸得到积崇。 2 ) 构建异柠檬酸裂解酶编码基臣ja c e A 链先 或定点修饰的突变株，切断或减弱乙醛酸循环 口碳二投酸是由C 0 2 崮定反应科己酶酸循环 所提供的。叼断减弱乙醛酸循环，C 0 2 固定反应所 ：与的比例兢会增大，支路代谢的切断或强弱会直接 导致土代谢流通缝的增大进而增加I 谷氨酸的产 量， 3 ) 构建柠檬酸台成酶基冈p r p C 】高被表达的 条件突变茁株 柠檬鲤台成酶至能荷I _ 2 j 节、备氩酸的反馈r - l l 遏 和婀砸乌头酸的反馈抑制部分或全部觯豫反馈阻趟 和反馈抑制将增加二_ 三攘陵德环z f t 从柠檬酸 in 耐 戊随代谢通量。 4 ) 构建各氯酸脱氯酶基囡g d h 定c _ 囊埂_ | i j 谷氢酸埘谷氧酸脱氯酶存在反馈阻强和反艘 抑制将备氮酸脱钮酶基凼进行定点蒋变获搿g d h 基园组成型表选突变株，有效地解除反馈渊节。 2 敲赊或磕弱答氨酸生产菌T G 8 2 6 的发酵副 产物的合成途径 flj 敲睬乳酸台成的关键酶乳酸脱氧酶基囡 r d h l ) 乳酸是谷氩酸发酵过程的丰耍剐声物苣的丈 量耘累影响到谷担酸的产景以缱糖酸转化率，司时 也影响到F 游提取过程。啪此敲豫乳醢脱氢酶基吲 ( d h l ) 能够避免磷架的渍费，提高备氟醴的产牢。 ( 2 ) 减弱发酵过群副产物杂蛋白的台成 技酵过程会产扛大最的杂蚩白，也是备氧酸致 酵的主要副产物。特别是大量可溶性崔白的仃红全 严重影响提取操作。通过丝因上 l 干段，限制杂蚩 臼的生成对1 I 提高谷氨酸的产率嗣睛洁生产起到 积极的作用， 矿珏