仲恺农业工程学院毕业论文油茶籽粕中蛋白质的提取工艺研究姓 名 林华剑院（系） 轻工食品学院专业班级 食品质量与安全2008级（2）班学 号 200810724228指导教师于辉职 称讲师论文答辩日期 2012年5月7日仲恺农业工程学院教务处制学生 承 诺 书本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。其中的实验数据全都是通过实验而得来的，没有抄袭别人的成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。如违反上述要求，本人愿承担一切法律后果。 承诺人： 年 月 日摘要本论文以油茶籽粕为原料，采用响应面设计，优化了油茶籽粕蛋白质的碱提酸沉法提取工艺，并在碱提的时候加入超声波辅助提取。响应面优化结果表明，油茶籽粕蛋白质的最佳提取工艺参数为：碱提工序油茶籽粕粒度为80目，料液比为1:25，pH值为11，超声波作用功率为800W，超声波作用时间为30min。在此条件下，油茶籽粕蛋白质的提取率为54.49%。关键词油茶籽粕 蛋白质 提取 超声波目 录 1 前言11.1 国内植物蛋白质资源利用情况11.2 开发植物蛋白质资源的必要性11.3 蛋白质的分离纯化21.4.2 油茶籽蛋白氨基酸组成51.4.2 油茶籽粕国内外研究情况61.4.3 本论文研究的意义、目的及内容62 实验材料和方法72.1 实验材料72.1.2实验原料72.1.3主要试剂72.1.4主要仪器设备82.2 实验方法82.2.1 油茶籽粕基本组成成分测定82.2.2油茶籽粕蛋白的提取工艺流程82.2.3 油茶籽粕蛋白等电点的测定92.3 影响油茶籽粕蛋白提取率的单因素实验92.3.1 碱提工序中油茶籽粕粒度对蛋白质提取率的影响92.3.2 碱提工序中料液比对蛋白质提取率的影响102.3.3 碱提工序中浸提液pH值对蛋白提取率的影响102.3.4 碱提工序中超声波作用功率对蛋白质提取率的影响102.3.5 碱提工序中超声波作用时间对蛋白质提取率的影响102.3.6 碱提工艺的优化102.3.7 酸沉103 结果与分析113.1 油茶籽粕基本组成成分测定结果113.2 油茶籽粕等电点的测定结果113.3 碱提工序中油茶籽粕粒度对蛋白质提取率的影响123.4 碱提工序中料液比对蛋白质提取率的影响133.5 碱提工序中浸提液pH值对蛋白提取率的影响143.6 碱提工序中超声波作用功率对蛋白质提取率的影响153.7 碱提工序中超声波作用时间对蛋白质提取率的影响163.8 碱提工序的工艺条件优化163.8.1 响应面二次方程数学模型的建立及最佳化分析163.8.2 因素间的交互影响193.9 酸沉蛋白质得率214 结论与展望224.1 结论224.2 展望22参考文献23Abstract24致 谢25仲恺农业工程学院毕业论文(设计)成绩评定表2627 / 331 前言1.1 国内植物蛋白质资源利用情况我国是一个农业大国，历史上由于畜牧业不发达，植物性蛋白食品在我国一直占据着较重的地位。据1992年联合国粮农组织估算，我国每人每天食物供应中，蛋白质为67.4gd其中植物蛋白占88.8，动物蛋白占l1.2。低于世界人口平均供给水平(70.8gd)，尤其是完全蛋白质供给量更低1。随着国民经济和畜牧业的发展，我国蛋白质食品供给的量和质都有了很大的发展。作为一个农业大国，具有利用植物蛋白质的明显优势，植物蛋白质种类多、资源丰富，主要有来自米麦等谷物蛋白、油料种子及其饼柏蛋白质、红花蛋白质、芝麻蛋白质、椰子蛋白质、籽粒苋蛋白质等，还有新开发出的一些其他蛋白质资源，如单细胞蛋白质、螺旋藻等2。由于我国人口众多，其发展水平远不能满足人民生活的需要。据估计，到2012年，我国人均占有粮食也只能徘徊在450550kg左右，而不会有大的突破。这就是说，我国不可能拿出更多的粮食作饲料，发展养殖业大量地增加动物蛋白质的供给量。所以，我国必须走以发展植物蛋白加工业为主，以发展畜、禽、鱼养殖业为辅的道路3。同时，采取有效措施增加脂质和蛋白质的有效供给，也是解决我国16亿人口在2030年的食物需求，保持基本营养平衡的最优先发展领域4。1.2 开发植物蛋白质资源的必要性当今世界，由于全球经济的快速发展，人们生活水平得到了极大地提高和改善，对肉、蛋、奶、禽、鱼的需求量成倍的增长，促使畜禽、水产养殖业的发展迅猛，造成了饲养畜禽所需饲料原料资源的紧张和短缺，特别是蛋白质资源更为紧张。我国是世界第一人口大国、农业大国，以世界7%的土地、养活着世界22%的人口，多年来我国粮食总产量维持在4.5亿吨4.9 亿吨，人均粮食占有量为400kg左右，只有美国的1/3。近5年来,我国粮食总产量连年下降，2003 年已从1998 年的5.1亿吨下降到4.3 亿吨。随着我国养殖业连续20 年来以平均9%以上的高速度增长，畜牧主产区的饲料资源短缺问题也将越来越严重，尤其是蛋白质饲料资源近年年缺口将达到3000 万吨以上。目前，我国饲料年产量已达7000余万t，若按蛋白质平均含量16计算，年需100的蛋白质1100多万吨。能量饲料中蛋白质一般含量8左右，在全价饲料中一般占到65，就是这样也只能满足蛋白质需求量的400万吨左右，还短缺700余万吨纯蛋白。众所周知，蛋白质饲料中蛋白质含量平均按40计算，最终还缺1750万吨蛋白质饲料。据计算，目前全国各种饼粕、血粉、饲料酵母、羽毛粉和国产鱼粉等总合起来也仅能满足7080，余下的2030必须依靠进口和国内资源进一步开发利用。当前若依靠进口蛋白质饲料是不现实的，如何把现有的蛋白质资源充分合理地利用，如何进一步开发新的蛋白质资源，愈来愈成为饲料工业迫切需要解决的问题。1.3蛋白质的分离纯化1.3.1 蛋白质的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 1.3.1.1 水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提取过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔/升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M 磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。 1.3.1.2 有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。1.3.2 蛋白质的分离纯化1.3.2.1根据蛋白质溶解度不同的分离方法蛋白质的盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。等电点沉淀法蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。低温有机溶剂沉淀法用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。 1.3.2.2 根据蛋白质分子大小的差别的分离方法透析与超滤透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。超滤法是利用高压力或离心力，使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。凝胶过滤法也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（SepHadex ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。 1.3.2.3 根据蛋白质带电性质进行分离蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。电泳法各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚