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白藜芦醇影响HT-29结肠癌细胞转移侵袭分子机制的初步研究 摘要:探讨白藜芦醇对结肠癌细胞株HT-29侵袭机理蛋白质水平的影响。 用080M白藜芦醇处理HT-29结肠癌细胞24h,采用蛋白质印记技术检测白藜芦醇对Bcl-2、cyclinD1蛋白质水平的影响。运用明胶酶谱法对明胶酶A(MMP-2)和明胶酶B(MMP-9)进行测定其活性。本实验均以-actin为内参进行分析。白藜芦醇处理诱导Bcl-2蛋白质表达量增加、cyclinD1蛋白质表达量减少,-actin蛋白质表达量不变。MMP-2、MMP-9酶活性降低。关键词:白藜芦醇;HT-29细胞;Bcl-2;MMP-2;MMP-9引言:白藜芦醇(Resveratrol,Rev)化学名称为3,4,5-三羟基-反-均二苯代乙烯,分子式C14H12O3,结构如图1.1所示,分子量228.2,以游离态(顺式-、反式-)和糖苷结合态(顺式-、反式-)两种形式存在,是一种植物抗毒素的多酚类活性单体,广泛存在于葡萄、花生、虎杖等植物性食物或药物中。图1.1 白藜芦醇结构式1940年人们首次从毛叶藜芦的根部分离获得白藜芦醇。白藜芦醇作为天然的肿瘤化学预防剂,对肿瘤的起始、促进、发展三个阶段均有抑制作用:能够抗突变、抗氧化、抑制自由基并诱导期药代酶(抗起始活性);还能抑制环氧化酶(COX)的环氧化酶和过氧化氢酶双重活性,具有很强的抗炎作用(抗促进活性)。还具有抗动脉粥样硬化和冠心病,缺血性心脏病,高血脂的防治作用。近年来肿瘤发病率有上升的趋势。大量的体内、体外抗癌试验结果表明,白藜芦醇对多种肿瘤,如肝癌、乳腺癌、皮肤癌、结肠癌、肺癌等均具有潜在的抗癌活性。鉴于白藜芦醇的潜在抗癌活性,加上和人类饮食关系密切,白藜芦醇已成为肿瘤防治中的研究热点。1. 实验内容 1.1 实验试剂:白藜芦醇 ,1640培养基,GIBCO ,青霉素 ,链霉素 ,L-谷氨酰胺(L-glutamine),HEPES,PBS ,0.25%胰酶细胞消化液 ,胎牛血清,二甲基亚砜(DMSO) ,1640培养基 ,Western及IP细胞裂解液 ,BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型),SDS-PAGE蛋白上样缓冲液,Acryl/bis solution ,TEMED,Western一抗稀释液 ,脱脂奶粉 ,Actin抗体,Bcl-2抗体,14-3-3抗体,cyclinD1抗体,辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L) ,辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L),过硫酸铵,SDS,Tris,NaCl,Tween-20,甘氨酸,甲醇,Beyo ECL Plus,浓盐酸,米吐尔,对苯二酚,溴化钾,无水亚硫酸钠,无水碳酸钠,硫代硫酸钠,硼酸,钾明矾,Beyo ECL Plus A液,Beyo ECL Plus B液,Tris-Hcl,Trition X-100 ,NaCl,Brij-35,考马斯亮蓝(R250),乙酸,溴酚蓝,甘油,甲醇 1.2 实验仪器:生物安全柜,二氧化碳培养箱 ,二氧化碳钢瓶,高压蒸汽灭菌锅,电热恒温鼓风干燥箱,TGL-20M台式高速冷冻离心机, 数显恒温水浴锅HH-1,超低温冷冻冷藏柜,MILLIQURE超纯水仪,冷藏冷冻冰箱,电子天平(型号为AL204),电泳仪 ,转膜仪,制冰机,电泳仪 1.3.1 HT-29细胞培养l 细胞培养的准备1)玻璃器皿的清洗和消毒2)金属过滤器及其他器材的消毒3)无菌室的消毒l 细胞培养及传代细胞在含10%胎牛血清的1640培养基中,于5%CO2,37培养箱中常规培养。待细胞长满至培养瓶底面积80%之后传代,全部实验均用指数生长期细胞。传代要根据细胞生长情况而定。传代时间的长短与接种细胞的类型和数量的多少有关,加太稀或太密均影响传代时间。一般接种细胞密度范围为(2.5-5)104细胞数/ml。1.3.2 细胞的处理l RPMI 1640培养液的配制l 白藜芦醇溶液的配制1.3.3 蛋白质浓度测定及标准曲线的制作l BCA检测步骤1) 取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中,充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。 2)取适量25mg/ml蛋白标准,稀释至终浓度为0.5mg/ml。 3)根据样品数量,按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。4)将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20l加到96孔板的标准品孔中,加标准品稀释液补足到20l。5)加适当体积样品到96孔板的样品孔中,加标准品稀释液到20l。6)各孔加入200l BCA工作液,37放置20-30分钟。7)测定OD值,540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。1.3.4 Western blottingl 细胞总蛋白的提取1)取经白藜芦醇白藜芦醇处理过的细胞,吸去培养基,用PBS洗涤,每孔加入90LIP细胞裂解液,作用3分钟,细胞刮刀刮下细胞,吹打使破碎完全,吸取悬液于1.5mLEP管中,离心,取上清,分装,每孔样品做好标记-86保存。2)提取蛋白后使用BCA试剂盒及酶标仪测定提取液蛋白浓度。l 蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1)制样:根据上样量和各个样品蛋白质浓度计算上样体积。加5Loading buffer,吸打混匀,沸水浴加热变性样品15min,冷却至室温即可点样。2)电泳:进行SDS-PAGE,安装好电泳槽,恒压80V,开始电泳,至溴芬蓝距胶底约1厘米左右停止。3)转膜:NC膜在转移缓冲液中浸泡10min;PVDF膜先在甲醇中浸泡30s,再在转移缓冲液中浸泡10min;膜的预处理应在电泳结束前做好,电泳一结束开始转膜。配好的转移缓冲液倒入干净磁盘中,将夹板泡沫泡在缓冲液中,尽量赶出气泡。将胶从电泳槽中小心取出平放泡在磁盘里,除去浓缩胶和两边未点样的分离胶。夹板水平放置,依次放上海绵,大滤纸,小滤纸,分离胶,转移膜,大滤纸,海绵,夹好。按照胶在阴极膜在阳极的方向将装好后放入电泳槽,倒入的缓冲液至少没过胶上端,接通电源进行转移。转膜条件按所转移蛋白质的分子量定,若为小分子,则条件为恒流350mA,60min,若为大分子,则条件为恒流350mA,120min。4)封闭:电泳结束后取出转移膜,蛋白面朝上放在封闭剂的培养皿中,室温摇床低速震荡1小时或48过夜。5)免疫反应:从封闭剂中取出膜,蛋白面朝上置于培养皿中,用TBS-T,室温摇床低速洗涤3次,时间分别为10 min,10min,5 min。一抗:使用一抗稀释液将一抗稀释相应的浓度。使用杂交袋室温摇床孵60min90min或4缓慢摇动过夜。去除一抗:从一抗中取出膜,蛋白面朝上置于培养皿中,用TBS-T,室温摇床低速洗涤3次,时间分别为10min,10min,5min。二抗:使用封闭剂将二抗稀释相应的浓度。使用杂交袋室温摇床孵60min90min。除二抗:从二抗中取出膜,蛋白面朝上置于培养皿中,用TBS-T,室温摇床低速洗涤3次,时间分别为10 min,10 min,5 min。6)感光:取Beyo ECL Plus A液 Beyo ECL Plus B液,根据膜的大小1:1混合,将膜蛋白面朝上铺在保鲜膜上,将混合液均匀滴加在蛋白面上;沥干膜,将膜蛋白面朝下铺在展平的保鲜膜上,四周折回来呈信封状,再将膜蛋白面朝上放置;将膜固定在暗匣中,蛋白面保鲜膜与胶片接触。合上暗匣曝光30s3h;取出胶片,将胶片浸没在显影剂里显影10s3min;从显影液中取出胶片,在自来水中洗涤数次,浸没在定影剂中,1min左右取出;自来水冲洗干净,自然干燥观察结果。1.3.5 明胶酶谱法1)制备75g/L的聚丙烯酰胺凝胶,使用小型电泳糟,凝胶厚度为0.75mm。凝胶聚合后,加入40 g/L浓缩胶。电泳缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液。2)样品与等量加样缓冲液混合,取20l加入加样孔在4下40mA恒流电泳60min。3)电泳结束后,在室温下将凝胶置于25ml/L洗脱液中振荡洗脱2次,每次30分钟,洗去胶中的SDS,恢复酶的活性。4)将凝胶置于孵育缓冲液。5)孵育结束后经染色液,及脱色液脱色显示出MMP-2和MMP-9为位于蓝色背景上的透亮带。6)此凝胶经凝胶成像仪扫描,使用分析软件测定酶分解条带的密度,根据样品中蛋白浓度计算出样品中酶的比活性。在电泳中,同时加入预染的已知分子量的蛋白Mark以计算条带的分子量。2 结果与分析2.1 蛋白质浓度标准曲线把HT-29细胞经不同浓度白藜芦醇(0、10、20、40、60、80mol/L)处理24h后提取的蛋白质进行浓度测定,数据如表2.1所示,得标准曲线如图2.1所示。表2.1 080M白藜芦醇处理的样品里蛋白质浓度标准蛋白量(l)PBS稀释液(l)BCA工作液(l)吸光度(A)0202000.10931192000.13342182000.15174162000.19098122000.25911282000.33611642000.38602002000.4650图2.1 蛋白质浓度标准曲线由表2.1所测定的数据做蛋白质标准曲线如图2.1,曲线的线性回归方程为:y=57.184x-6.6461,线性相关性系数R2=0.9976。该蛋白质的标准曲线,曲线相关度在0.99以上,基本符合实验准确性要求。 2.2 Westen boltting结果 2.2.1 白藜芦醇对Bcl-2蛋白表达的影响 图2.2 不同浓度白藜芦醇处理后对Bcl-2蛋白表达的影响Bcl-2表达的抑制均可导致线粒体膜渗透性的改变甚至破裂,继而引起线粒体细胞色素C的释放,而细胞色素C可以进一步激活caspase-3并诱发凋亡的发生,从而抑制了细胞凋亡。Mahyar-Roemer等在研究中发现HCT116细胞和HCT116Bax-P-细胞经白藜芦醇作用后均出现线粒体膜破裂与细胞凋亡迹象,虽然其中的HCT116Bax-P-细胞的线粒体膜破裂出现相对较晚,凋亡幅度也相对较小,但该结果说明白藜芦醇还可以通过引发Bcl-2家族非依赖性的线粒体损伤而诱导细胞凋亡14。有研究表明结肠癌组织中有不同水平Bag-1和Bcl-2蛋白的高表达,它们可作为结肠癌早期筛选的一项指标,并对疾病的预后有着重要意义。 由图2.2 可知,白藜芦醇对Bcl-2蛋白质表达有抑制作用,因此白藜芦醇能抑制癌细胞的侵袭。2.2.2 白藜芦醇对cyclinD1蛋白表达的影响 图2.3 不同浓度白藜芦醇处理后对cyclinD1蛋白表达的影响现代学者在观察肿瘤的不协调生长和增生时,发现了与细胞周期调控有关的蛋白,并认为肿瘤与细胞周期调控失常有着密切联系。cyclinD1蛋白在各种恶性皮肤肿瘤中的表达显著升高,包括鳞癌、黑色素瘤和恶性纤维组织细胞瘤等。cyclinD1作为细胞周期调节因子之一,其过度表达是多种人类原发性肿瘤的特征,对肿瘤的诊断和预后判断具有重要意义。如图2.3所示,结果表明,白藜芦醇对cyclinD1蛋白质的表达有抑制作用,即可抑制肿瘤的侵袭。2.2.3 白藜芦醇对14-3-3蛋白表达的影响 图2.4 不同浓度白藜芦醇处理后对14-3-3蛋白表达的影响14-3-3蛋白通过与细胞内许多参与细胞凋亡过程的信号蛋白相互作用,从而抑制细胞凋
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