ICS 65.020.30 B 40 DB32 江苏省地方标准 DB32/T 36852019 猪萨佩罗病毒检测技术规程 Detection technical regulation for Porcine Sapelovirus 2019 - 12 - 04 发布 2019 - 12 - 25 实施 江苏省市场监督管理局 发 布 DB32/T 36852019 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业科学院提出并归口。 本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本标准主要起草人：李彬、范宝超、孙杰、何孔旺、郭容利、周金柱、俞正玉。 DB32/T 36852019 1 猪萨佩罗病毒检测技术 1 范围 本标准规定了猪萨佩罗病毒的核酸检测（RT-PCR法）、血清学检测（间接ELISA方法）等要求。 本标准规定的RT-PCR法适用于本病毒的抗原确诊，间接ELISA试验适用于血清学的普查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 猪萨佩罗病毒 Porcine Sapelovirus（PSV） 单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科萨佩罗病毒属。该病毒能引起中度或严重的神经系统紊乱、 腹泻、繁殖障碍和肺炎，感染猪康复后仍然会继续排毒，成为重要的病毒传播源，因此该病毒在猪群中 感染率很高，严重威胁着养猪业的健康发展。 4 核酸检测（RT-PCR 法） 4.1 材料准备 PCR引物P1 5- GAGAAGGTAAAGATGGGCAAAAC - 3和P2 5- AATACAGGATGACACAGGAAGGG- 3（见附录B）。PCR相关试剂。猪萨佩罗病毒阳性病料RNA提 取物反转录为cDNA作为阳性对照，水作为阴性对照。高速离心机（10000 r/min）、PCR仪、电泳仪、 水平电泳槽凝胶成像系统（或紫外投射仪）、移液器等仪器。 4.2 操作步骤 4.2.1 DNA模板制备 按NY/T 541规定的方法， 采集待检猪的病料置于-20以下冰箱保存。 临床组织病料样品加入1 PBS 缓冲液进行充分研磨后冻融3次，高速10000 r/min离心5 min，取上清提取病毒总RNA（参照RNA提取试 剂盒说明书），并反转录成cDNA（利用反转录试剂盒），保存备用。 4.2.2 PCR DB32/T 36852019 2 PCR反应体系：2xTaq Master Mix 12.5 L，P1（20 pmol/L）1.0 L，P2（20 pmol/L）1.0 L，模 板2 L5 L，加ddH2O至总体积 25 L。反应条件：预变性94 5min，94 30s，扩增的退火温度分 别采用55进行扩增30 s，72 30 s， 35个循环72延伸10 min。 4.2.3 电泳 制备1 %琼脂糖凝胶，内加适量溴化乙锭或其替代物，取PCR产物10 L 20 L分别与适量加样 缓冲液混合后，加样到电泳孔中，9 V/cm恒压下电泳15 min30 min。将电泳好的凝胶放到紫外投射仪 或凝胶成像系统上观察结果。 4.3 结果判定 阳性对照扩增到689 bp条带，同时阴性对照无条带时，试验成立。 在试验结果成立的前提下，如果样品扩增到689 bp条带，可确认为样品为猪萨佩罗病毒PCR阳性。 4.4 废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物，应做好无害化处理，检测过程中防止交叉污染的措施见附录A。 5 血清学检测（间接 ELISA 方法） 5.1 材料准备 猪萨佩罗病毒重组3C表达抗原，酶标抗体，标准阴性血清、标准阳性血清，酶标板及其他必要的 试验溶液和酶标仪、移液器等仪器。待检血清样品采集于疑似患病猪场。 5.2 操作步骤 5.2.1 包被：用包被液将猪萨佩罗3C蛋白抗原稀释到工作浓度加入酶标板孔内，每孔100 L，4 冰箱 过夜。 5.2.2 洗涤：甩掉酶标板孔内的液体，加入洗涤液200 ul/孔，室温下浸泡5 min，甩去洗涤液，再重新 加入洗涤液，连续洗3次，最后一次甩掉洗涤液后，拍干酶标板。 5.2.3 封闭：各孔加入5%的脱脂乳封闭液200 L，37 作用2 h。按5.2.2步骤洗涤四次。 5.2.4 加入待检血清和阴、阳性血清对照：待检血清用稀释液1:320稀释，每孔加100 L。同时将阴、 阳性血清作对照。37 作用45 min，重复5.2.2步骤，洗涤4次。 5.2.5 加入酶标抗体： 用稀释液将酶标抗体按1:10000稀释， 每孔加入100 L， 37作用30 min， 重复5.2.2 步骤，洗涤4次。 5.2.6 加入底物，每孔加100 L，室温避光显色8 min。 5.2.7 终止反应，每孔加入50 L终止液终止反应。 5.2.8 测定光吸收值(OD)，在酶联免疫检测仪上于450 nm波长处测定光吸收值(OD)。 5.3 结果判定 用酶标仪检测OD值，计算S/P值，S/P值=（样品血清OD450 nm值-阴性血清OD450nm值）/（阳性 血清OD450 nm值-阴性血清OD450 nm值）。当样品S/P值0.212时判为 阳性；0.150样品S/P值0.212时，判为疑似。 DB32/T 36852019 3 _