资源预览内容
第1页 / 共63页
第2页 / 共63页
第3页 / 共63页
第4页 / 共63页
第5页 / 共63页
第6页 / 共63页
第7页 / 共63页
第8页 / 共63页
第9页 / 共63页
第10页 / 共63页
亲,该文档总共63页,到这儿已超出免费预览范围,如果喜欢就下载吧!
资源描述
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-PAGE 一、什么是SDS 十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS) 是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体 (monomer)和分子团(micellae)的混合形 式存在 SDS的作用 破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子 之间的非共价键,使蛋白质变性而改变原 有的构象,保证蛋白质分子与SDS充分结合 而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物 一、SDS-PAGE的基本原理 (一)蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离 子去污剂和强还原剂后,蛋白质亚基 的电泳迁移率主要取决于亚基分子量 的大小,而电荷因素可以被忽略 1、SDS 阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂 断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构 2、强还原剂 巯基乙醇(-mercaptoethanal) 二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT ) 使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂 SDS和还原剂的作用: (1)分子被解聚或组成它们的多肽键 (2)氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负 电荷的蛋白质-SDS胶束 (3)蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超 过了蛋白质分子原有的电荷量,消除 了不同分子之间原有的电荷差异 蛋白质-SDS胶束的特点 (1)形状像一个长椭圆棒 (2)短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶 束基本上是相同的 (3)长轴的长度则与亚基分子量的大 小成正比 胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁 移率不再受蛋白质原有电荷的影响, 而主要取决于椭圆棒的长轴长度,即 蛋白质或亚基分子量的大小。 当蛋白质的分子量在15KD200KD 之间时,电泳迁移率与分子量的对数 呈线性关系 3、影响SDS电泳的关键因素 (1) 溶液中SDS单体浓度 大多数蛋白质与SDS结合的重量比 为1:1.4 (2) 样品缓冲液的离子强度 低离子强度的溶液中,SDS单体才 具有较高的平衡浓度 (3) 二硫键是否完全被还原 当二硫键被彻底还原后,蛋白质分 子才能被解聚,SDS才能定量地结合到 亚基上而给出相对迁移率和分子量对 数的线性关系。 (二)缓冲系统的选择 一般情况下,在被分析的蛋白质 稳定的pH范围,凡不与SDS发生相互作 用的缓冲液都可以使用,但缓冲液的 选择对蛋白质的分离和电泳的速度是 非常关键的 电泳缓冲液的种类: 1、磷酸缓冲液 2、Tris-醋酸钠缓冲系统 3、咪唑缓冲液系统: 比磷酸缓冲系统的导电性低,电泳速 度要比后者快一倍 4、尿素系统: 适用分子量低于15KD的蛋白样品 5、Tris-甘氨酸系统: 使用最多的缓冲液 6、Tris-硼酸盐缓冲液: 测定糖蛋白的分子量 (三)凝胶浓度的选择 由于SDS电泳分离并不取决于蛋白 质的电荷密度,只取决于分子解聚后 SDS-蛋白质胶束的大小,因此凝胶浓 度的选择会直接影响分辨率。 不同分子量范围的蛋白质应选用 不同的凝胶浓度 (四)分子量测定 1、相对迁移率(Rf) Rf即用每个带的迁移距离除以溴酚 蓝前沿的迁移距离得到的。 测量位置应在蛋白带的中央。 蛋白带迁移距离 Rf= 溴酚蓝迁移距离 蛋白带迁移距离 固定前的凝胶长度 Rf= X 干燥后的凝胶长度 溴酚蓝迁移距离 2、作图 以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐 标,Rf为横坐标绘图 3、通过测定未知蛋白质的Rf值,便可在标 准曲线上读出他的分子量 二、去污剂的选择 无离子去污剂:Lubro W;Brij35, Tween Triton 阳离子去污剂:cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) cetylpyyridinium (CPC ) 阴离子去污剂:SDS deoxycholate 三、方法 1、分类 (1)根据对样品的处理方式的不同 还原SDS电泳 非还原SDS电泳 带有烷基化作用的还原SDS电泳 (2)根据缓冲系统和凝胶孔径的不同 连续电泳 不连续电泳 (3)根据电泳的形式 圆盘电泳 垂直电泳 平板电泳 水平电泳 2、操作 (1) 制备分离胶 (2) 制备积层胶(堆积胶) 分离胶聚合之后 (3) 加样品 样品的处理 在蛋白溶液中加入过量的SDS后,可引起以 下的反应: 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球型 还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或-二巯基乙醇后 ,蛋白质被完全去折叠,只根据分子量分离 带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保 护SH基团,而得到窄的电泳带 非还原的SDS处理 许多样品,如生理体液、血清或尿素, 一般只需用1%SDS在100煮沸3分钟,并不需 要加还原剂,此时二硫键不能被断裂,蛋白 并没有完全被去折叠 (4) 电泳 (5) 固定 (6) 染色 考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue) R-250 三苯基甲烷,红蓝色,每个分子含 有两个SO3H基团,偏酸性,和氨基黑 一样也是结合在蛋白质的碱性基团上 G-250 二甲花青亮蓝,蓝绿色。 银染色 银染的机制是将蛋白带上的硝酸 银(银离子)还原成金属银,以使银 颗粒沉积在蛋白带上 (7) 照相,凝胶干燥 (8) 定量测定 3、电泳过程中的不正常现象 (1)“微笑”现象 指示剂前沿呈现两边向上的曲线 形,说明凝胶的不均匀冷却,中间部 分冷却不好 (2)“皱眉”现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引 起的,特别是当凝胶和玻璃板组成的“ 三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶 聚合不完全 (3)“拖尾”现象 样品溶解不佳引起。 (4)“纹理”现象 由于样品中的不溶颗粒引起的。 (6)带太宽 加样量太多或加样孔泄漏引起
网站客服QQ:2055934822
金锄头文库版权所有
经营许可证:蜀ICP备13022795号 | 川公网安备 51140202000112号