分子生物学 第一章 绪论 第一节 分子生物学的定义和研究内容 一、定义 分子生物学是从分子水平研究生命现象及其规 律的一门新兴、前沿学科。 它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构、功能 及其在信号传递中的作用为研究对象，其发展非常 迅速。 分子生物学以其崭新的观点和技术向其他学科 的全面渗透，推动了许多学科向分子水平发展。 使细胞生物学、遗传学、发育生物学、神 经生物学和生态学由原来的经典学科变成了生 命科学的真正前沿科学，形成了一系列交叉学 科，如分子遗传学、分子生态学、分子免疫学 、分子病毒学、分子病理学、分子肿瘤学和分 子药理学等。分子生物学是生命科学的核心前 沿。 不同种属生物的表现形式多种多样和千姿 百态，但是，生命活动的本质却是高度一致的 。例如绝大多数生物遗传取决于DNA；除少 数例外，遗传密码在整个生命世界中都是一致 的。又如核酸一级结构和蛋白质一级结构的对 应关系以及蛋白质的有序合成，也表现出高度 一致性。 因此，分子生物学开辟了研究各种不同种属生 物的生命现象最基本、最重要的途径。 分子生物学的发展为人类认识生命现象带 来了前所未有的机遇，也为人类利用和改造生 物创造了极为广阔的前景。 由于生物化学、生物物理学、细胞生物 学、遗传学、应用微生物学及免疫学以 及数学、化学、物理学、计算机科学和 信息学等专业技术的渗透，分子生物学 已发明和创造了一系列新的技术。 例如DNA及RNA的印迹转移、核酸分子 杂交、DNA克隆或重组DNA、基因体外 扩增、DNA 测序等等，以及研究蛋白质 一级结构、二级结构和三维结构与功能 的分析技术。 其中重组DNA(recombinant DNA)技术是现代 分子生物学技术的核心。 重组DNA技术又称为基因操作(gene manipulation )、分子克隆(molecular cloning)、 基因克隆(gene cloning) 或基因工程（gene engineering）等。 这些名词彼此间存在某些微小的差别，在不同 情况和不同条件下常常交换使用。 “基因操作”定义为：通过任何方法将细胞外构 建的DNA分子(或片段)插入病毒、质粒或其他 载体系统，形成遗传物质的重新组合，使它们 能够进入宿主细胞内，并能在其中继续扩增。 而“重组DNA 技术”狭义上具“基因操 作”相同的含义，但它涉及范围更广泛 ，甚至泛指分子生物学中与DNA水平 研究有关的技术。 因此，分子生物学技术已成为推动生 物科学的各个领域向分子水平发展的 重要工具或手段，也是服务于人类和 社会，推动医药和工、农业发展的强 大动力。 二、分子生物学的研究内容 分子生物学的研究内容主要包括以下三个方面 。 1、核酸分子生物学： 主要研究核酸的结构及其功能。 2、蛋白质分子生物学： 主要研究蛋白质的结构与功能。尽管人类对蛋 白质的研究比对核酸研究的历史要长得多，但 由于其研究难度较大，与核酸分子生物学相比 发展缓慢。 3. 细胞信号转导：细胞信号转导的分子生物学 主要研究细胞内、细胞间信息传递的分子基础 。 第二节 分子生物学发展简史 一、生物遗传物质的发现 早在1868年，Miescher F从脓细胞中分离出 细胞核，用稀碱抽提再加入酸，得到了一种 含氮和磷特别丰富的物质，当时称其为核素 (nuclein)。1872年，他又在鲑鱼精子细胞核 中发现了大量的这类物质。由于这类物质都 是从细胞核中提取出来的，而且又是酸性， 故称其为核酸(nucleic acid)。 二、现代分子生物学的建立 1950年Astbury WT在一次题为“Adventures in molecular biology”讲演中首先使用“分子 生物学”这一术语, 用以说明它是研究生物 大分子的化学和物理学结构。 1953年Watson JD和Crick FH提出“DNA 双 螺旋结构学说”（生理医学奖），是分子 生物学创建的里程碑。 该学说启动了分子 生物学及重组DNA技术，开创了分子遗传 学基本理论的黄金时代。 其主要进展有： 1953年，Watson和CrickNature杂志上 发表一篇震动生物学界的论文“脱氧核糖核 酸的结构”。 Watson和Crick的DNA双螺旋结构学说已被 普遍地视为分子生物学发展的最主要里程 碑，也是分子生物学及其技术的重要理论 基础。 1956年Kornberg, A.,首先发现DNA聚合酶（生 理医学奖）； 1957年，Hoagland MB等分离出tRNA，并对 它们在合成蛋白质中转运氨基酸的功能提出了 假设； 1958年，Meselson M及Stahl FW提出了DNA 半保留复制模型； 1958年，Weiss SB及Hurwitz J等发现依赖于 DNA的RNA聚合酶； 1961年Hall BD等用RNA-DNA杂交证明mRNA 与DNA序列互补；这些工作使RNA转录合成 的机制得以逐步阐明。 1963年，Holley RW 从酵母中提取丙氨酰转移 核糖核酸（tRNA）， 1965年，Holley测定了tRNA核苷酸序列(生理 医学奖)。 1968年，Okazaki R（冈崎）等提出了DNA不 连续复制模型； 20世纪70年代初获得DNA拓扑异构酶，并对 真核DNA聚合酶特性作了分析研究。这些都 逐渐完善了对DNA复制机制的认识。 三、现代分子生物学的深入发展 (一)重组DNA技术的发明 1基因克隆工具酶的发现： 1970年，Smith HO在微生物中发现一组目前 称之为限制性核酸内切酶的酶类，简称限制酶 (restriction enzyme)。（生理医学奖） Temin等从肉瘤病毒(一种逆转录病毒)中发现 了一种逆转录酶(reverse transcriptase)（生理医 学奖） 2DNA片段的体外连接：1972年，Berg P和 Jackson DA等首次将两个不同生物体来源的 DNA片段，在DNA连接酶的作用下进行连接( 或重组)，产生了第一个重组DNA分子。 3质粒的构建：1973年，Cohen S 构建了第 一个可用于 DNA 分子克隆的载体质粒 （plasmid）。 4核酸杂交技术：1969年，Pardue ML等 首先建立了细胞原位杂交技术。1975 年， Southern EM发明一种印迹杂交技术，被称 为 Southern 印迹或Southern转移技术。 5DNA序列分析技术：1977年，剑桥大学 Sanger F等创建了双脱氧末端终止法测定 DNA序列，与此同时，美国Maxam I和 Gilbert W发明了化学裂解法或部分降解法测 定DNA序列（化学奖）。 6聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR) ： 1985年，Mullis K首创聚合酶链式反应 (PCR)技术（化学奖）。该技术在体外模拟 细胞内DNA的复制过程，进行体外“基因扩 增”。 (二) 分子生物学技术的应用与发展 由于分子生物学的广泛渗透和应用， 反过来又推动了重组DNA技术和分子生物 学本身的发展。有关这方面的研究进展事 例不胜枚举。现仅就具有重大历史意义、 影响广泛深远的主要事件简述如下。 1癌基因的发现：1975年，Bishop JM和 Vermus HE在Rous肉瘤病毒(一种逆转录病毒) 中首次发现了第一个癌基因src。同时证明 src基因不是Rous肉瘤病毒所固有、而是来自 宿主细胞基因组，在所有小鸡细胞中都有其同 源副本。 2基因诊断：1976年，Kan YW应用分子杂 交技术，用cDNA探针进行溶液杂交，检测- 珠蛋白基因有无缺失，首次成功地进行了一例 珠蛋白合成障碍性贫血（又称为-地贫）纯 合子胎儿(胎儿水肿)的产前诊断。这也是首例 单基因遗传疾病的基因诊断。 3基因组文库的建立： 1978年，Smithies O等建立了第一个人类基因 组文库(genomic library)。 4基因工程生产人胰岛素： 1979年，Goeddel DV及其同事详细报道了他 们成功地用化学合成的人胰岛素基因在大肠 杆菌中进行了表达。随后Eli Lilly公司在1982 年获准销售基因工程生产的胰岛素。 5转基因动物： 1981年，Palmiter R和Brinster R利用基因 转移技术成功地建立第一个转基因小鼠，转基 因动物模型的建立，为研究基因功能及遗传病 的基因治疗提供了活体模型。 6. 人类基因治疗研究： 1990年4月，美国NIH的Blaese RM和Anderson WF 等首次将腺苷脱氨酶(ADA)基因导入至一 位患严重复合免疫缺陷症(SCID)的4岁小孩体 内，并取得一定疗效，开创了人类基因治疗（ human gene therapy）的先河，并为20世纪90 年代以来基因治疗研究蓬勃开展奠定了基础。 7基因工程抗体技术的建立和发展： 人们利用细胞工程技术研制出多种单克隆 抗体，为许多疾病的诊断和治疗提供了有效的 手段。 8DNA芯片（基因芯片、生物芯片）技术： 是指将大量探针分子固定于固体支持物上 ，与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个 探针分子的杂交信号强度而获取样品分子的数 量和序列信息。 （三）基因组研究的进展 基因组（genome）是指一个物种遗传信息的 总和。 2001年2月11日，参加人类基因组计划的六国 科学家、美国塞莱拉遗传信息公司、美国科 学杂志和英国自然杂志联合宣布，继科 学家于2000年绘制成功人类基因组工作框架图 之后，又绘制出了更加准确、清晰、完整的人 类基因组图谱，对人类基因组的面貌有了新的 发现。 人类基因数量远比预计的少，人类基因数 量仅有2.53万个左右，比以前估计的8万至 10万个要少得多。 通过进一步研究还发现，男女可能存在 巨大遗传差异，男性染色体减数分裂的突变率 是女性的两倍。并找到了很多与遗传病有关的 基因，包括乳腺癌、遗传性耳聋、中风、癫痫 症、糖尿病和各种骨骼异常的基因。 (四)基因表达调控机制的研究 1961年，Jacob F和Monod J最早提出操纵子学 说（生理医学），打开了人类认识基因表达调 控的窗口。 从80年代开始，人们逐步认识到真核基因的顺 式调控元件与反式作用因子、核酸与蛋白质间 的分子识别与相互作用是真核基因表达调控的 根本所在。 1981年，Altman S和 Cech TR同时发现了具 有催化自我剪接活性的RNA，称之为 ribozyme(核酶)（化学奖），参与基因表达的 调节。 （五）小分子RNA研究进展 1993年，Lee RC等发现线虫(C.elegans) lin-4 基因编码的小分子RNA，其长度为2261个 核苷酸反义RNA。 反义RNA能与lin-14 mRNA的3非翻译区（ untranslated region，UTR）反义互补结合， 阻断lin-14的翻译，降低线虫早期发育阶段lin -14蛋白的水平。 小干扰性RNA (small interfering RNA， siRNA)系2125个碱基对的短双链RNA，是 长双链RNA (dsRNA)被细胞内Dicer切割而成 。 siRNA能诱发细胞内基因沉默，使那些与双 链RNA有同源序列的