选修一 生物技术实践 专题一 传统发酵技术应用 专题二 微生物的培养与应用 知识排查 考点诠解 一、果酒与果醋制作的比较果酒制作果醋制作 发酵菌种酵母菌醋酸菌 反应式C6H12O66O26CO2 6H2O C6H12O62C2H5OH 2CO2 C6H12O62O2 2CH3COOH2CO2 2H2O C2H5OHO2CH3COOH H2O 对酸性环境耐酸性耐酸性 最适发酵温度1825 3035 发酵时间1012 d78 d 对氧的需求前期需氧，后期不需氧一直需氧 1.在果酒制作过程的前期通入空气或在发酵瓶(罐)中留有一 定的空间(大约1/3)，可以给酵母菌提供氧气，使其进行有 氧呼吸，为酵母菌的生长、增殖提供能量。酵母菌迅速增 殖，缩短发酵时间 。在产生酒精的阶段要求严格的厌氧 环境，此阶段如果有氧，则会抑制酒精发酵。 2果醋制作过程中要求始终通氧，因为醋酸菌是好氧细菌 ，缺氧时醋酸菌的生长、增殖都会受到影响。另外醋酸的 生成也会受到影响。 3制作中原料的消毒 (1)榨汁前葡萄的冲洗，应先冲洗再去枝梗，因为在去梗的同 时会使一些微生物侵入果实内部，给消毒带来一定的困难 。另外对于果酒的自然发酵，冲洗不要反复进行，因为其 他杂菌和酵母菌被洗去的机会是均等的，如果冲洗次数过 多，使酵母菌数量减少，使发酵周期加长，产生的酒精含 量下降。 (2)一般选用体积分数为70%的酒精，并不是酒精的含量越高 效果越好，因为含量过高会使细菌周围形成一层菌膜，酒 精不易进入细菌体内；70%的酒精可以迅速进入细菌体内 ，使体内的蛋白质变 性，将细菌消灭。 特点提示：(1)果酒制作和果醋制作过程都需要微生物的参与 ，但二者所需要的条件不同，如对温度、氧的需求。 (2)不同菌体最适发酵温度不同，与酶的最适温度不同有关。 4用重铬酸钾来检测 酒精时的对照实验 根据对照实验 的原则，在单一变量的前提下，用重铬酸钾 检测发 酵液中生成酒精的方法。 对照组试 管中加入2 mL白酒，实验组试 管中分别加入2 mL 发酵前和发酵后的果汁，再分别加入物质的量浓度为3 mol/L的H2SO43滴，振荡混匀，最后滴加常温下饱和的重 铬酸钾溶液3滴，振荡试 管，观察。 1泡菜的制作 按照清水与盐的质量比为41的比例配制盐水。将盐水煮沸 冷却。将经过预处 理的新鲜蔬菜混合均匀，装入泡菜坛 内，装至半坛时 ，放入蒜瓣、生姜及其他香辛料，继续 装 至八成满，再徐徐注入配制好的盐水，使盐水没过全部菜 料，盖好坛盖。在坛盖边沿的水槽中注满水，以保证坛 内乳酸菌发酵所需的无氧环境。在发酵过程中要注意经常 补充水槽中的水。发酵时间长 短受室内温度的影响。 2测定亚硝酸盐含量的操作中有关的几个问题 (1)实验 原理：亚硝酸盐遇到对氨基苯磺酸溶液和N1 萘基乙 二胺盐酸盐溶液时会呈现玫瑰红色。亚硝酸盐溶液的浓 度不同，呈现的颜色深浅不一，溶液浓度高，颜色深些； 浓度低，颜色浅些。 (2)药品：质量浓度为4 mg/mL的对氨基苯磺酸溶液、质量 浓度为2 mg/mL的N1 萘基乙二胺盐酸盐溶液、质量浓度 为5 g/mL的 NaNO2溶液(再配制成不同浓度，作为标 准 显色液)、提取剂(酸性条件下的氯化镉和氯化钡溶液)、 Al(OH)3乳液、物质的量浓度为2.5 mol/L的 NaOH溶液。 (3)制备样 品处理液时，氢氧化铝乳液的作用是吸附样品滤 液中的杂质 ，使滤液变得无色透明，以便于观察颜色变 化。 特别提醒：泡菜腌制过程中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化 (1)发酵初期：以不产酸的大肠杆菌和酵母菌活动为主，同时 ，还有一部分硝酸盐还原菌活动。该时期利用了氧气，产 生了厌氧环境，乳酸菌才开始活动。乳酸菌和乳酸的量都 比较少，而由于硝酸盐还原菌的活动，亚硝酸盐含量有所 增加。 (2)发酵中期：由于乳酸菌产生了大量乳酸，其他细菌活动受 到抑制，只有乳酸菌活动强烈。此期乳酸菌数量达到高峰 ，乳酸的量继续积累。由于硝酸盐还原菌活动受抑制，同 时形成的亚硝酸盐又被分解，因而亚硝酸盐含量下降。所 以亚硝酸盐在整个发酵过程中的含量变化趋势 如下图： (3)发酵后期：由于乳酸的积累，酸度继续 增长，乳酸菌活 动也受到抑制。乳酸菌数量下降，而硝酸盐还 原菌完全被 抑制。 三、微生物的营养及培养基的类型 1微生物的营养及功能 微生物的化学组成与其他生物大体相同，也是由C、H、O、 N、P、S等元素组成的，其中C、H、O、N占细胞干重的 90%以上，这些元素最终来自外界环境中的各种无机化合 物和有机化合物。这些化合物归纳成碳源、氮源、生长因 子、水和无机盐这五大类营养要素。 营养 物质 定义作用主要来源 碳源凡能提供所需碳元 素的物质 构成生物体的细胞物质 和一些代谢产物， 有些是异养生物的能 源物质 无机化合物：CO2、 NaHCO3；有机化合物： 糖类、脂肪酸、花生粉 饼、石油等 氮源凡能提供所需氮元 素的物质 合成蛋白质、核酸以及 含氮的代谢产物 无机化合物：NH3、铵盐、 硝酸盐；有机化合物： 尿素、牛肉膏、蛋白胨 等 生长 因子 生长必不可少的微 量有机物 酶和核酸的组成成分维生素、氨基酸、碱基等 水在生物体内含量很 高，在低等生物 体内含量更高 不仅是优良的溶剂而且 可维持生物大分子 结构的稳定 无机盐为微生物提供除碳 、氮以外的各种 重要元素，包括 大量元素 细胞内的组成成分，生 理调节物质某些化 能自养菌的能源，酶 的激活剂 (1)微生物最常利用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用 的氮源是铵盐 、硝酸盐。 (2)在微生物所需要的化合物中需要量最大的是碳源，新陈代 谢同化作用类型的划分可以利用的碳源类型为依据，能利 用无机碳源的为自养型，反之则为 异养型。 (3)对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物既是碳 源又是氮源和能源。 (4)微生物之所以需要补充生长因子，往往是由于缺乏合成这 些物质所需要的酶或合成能力有限。一些天然物质如酵母 膏、蛋白胨、动植物组织 提取液等可为微生物提供生长 因子。 (5)自养型微生物和异养型微生物的营养比较 营养型碳源氮源生长因子举例 自养型微生物 CO2、 NaHCO3 NH3、铵盐 、 硝酸盐等 一般不需要硝化细菌 异养型微生物糖类、脂肪 酸等 铵盐 、硝酸盐 、蛋白质等 有些种类需 要 乳酸菌 2.培养基的类型比较 划分 标 准 培养基 种类 特点用途 化学 成分 天然培 养基 含化学成分不明确的天然物质工业生产 合成培 养基 培养基成分明确(用化学成分已 知的化学物质配成) 分类、鉴定 用途 选择 培 养基 培养基中加入某种化学物质， 以抑制不需要的微生物的生 长，促进所需要的微生物 的生长 培养、分离出特定微生物(如 培养酵母菌和霉菌，可在 培养基中加入青霉素；培 养金黄色葡萄球菌，可在 培养基中加入高浓度食盐 ) 鉴别 培 养基 根据微生物的代谢特点，在培 养基中加入某种指示剂或化 学药品 鉴别 不同种类的微生物，如 可用伊红美蓝培养基鉴 别饮 用水或乳制品中是否 有大肠杆菌(若有，菌落 呈深紫色，并带有金属光 泽) 注意：病毒为非细胞结构生物体，专营活细胞寄生，目前不 能利用人工培养基来培养，需接种在动植物组织中才能增 殖。常用于培养病毒的是活鸡胚。 四、微生物培养中几种实验操作技术 1无菌技术 (1)消毒和灭菌的区别： 条件结果常用的方法 消毒 较为温和 的物理 或化学 方法 仅杀死物体表面 或内部一部分 对人体有害的 微生物(不包括 芽孢和孢子) 煮沸消毒法(如100 煮沸56 min可杀 死微生物的营养细 胞和一部分芽孢)、 巴氏消毒法、化学 药剂消毒法 灭菌 强烈的理 化因素 杀死物体内处所 有微生物，包括 芽孢和孢子 灼烧灭菌、干热灭菌 、高压蒸汽灭菌 (2)几种常用灭菌和消毒方法的比较： 灭菌和消毒 种类 主要方法应用范围 灼烧灭 菌酒精灯火焰灼烧微生物接种工具如接种环、接种 针或其他金属用具等，接种过 程中试管口或瓶口等 干热灭 菌干热灭 菌箱160170 加热12 h 玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金 属用具等凡不适宜用其他方法 灭菌而又能耐高温的物品 高压蒸汽灭 菌 100 kPa、121 维持 1530 min 培养基及多种器材、物品 灭菌和消毒 种类 主要方法应用范围 巴氏消毒法7075 煮30 min或80 煮 15 min 牛奶、啤酒、果酒和酱油等不 宜进行高温灭菌的液体 间歇灭菌法100 下蒸煮 3060 min连 续重复3 d，每天1次 含有葡萄糖或氨基酸等不耐高 温药品的培养基等 蒸汽持续灭 菌法 100 持续加热1530 min 微生物制品的土法生产或食用 菌菌种制备 紫外线消毒30W紫外灯照射30 min接种室空气 化学药物消 毒 用体积分数为70%75%的乙 醇、碘酒涂抹，来苏尔喷 洒等 用于皮肤、伤口、动植物组织 表面消毒、空气、手术器械 、塑料或玻璃器皿等 特别提醒：(1)酒精消毒时，体积分数为70%的酒精杀菌效果 最好，原因是浓度过高，使菌体表面蛋白质凝固成一层保 护膜，乙醇分子不能渗入其中；浓度过低，杀菌能力减弱 。 (2)消毒时一般不能杀死微生物的芽孢的原因是：芽孢是细胞 内形成的一个圆柱形或椭球形、厚壁、含水量极低、抗逆 性极强的休眠体，它抗热、抗化学药物、抗静水压能力极 强，一般细菌的营养细胞不能经受70 以上高温，但芽孢 有惊人的耐高温能力。 2倒平板 (1)培养基灭菌后，需冷却至50 左右时才能倒平板。 (2)左手拿培养皿，右手拿锥形瓶，左手拇指和食指将培养皿 打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开。 (3)整个操作在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。 (4)平板冷凝后要倒置的原因：防止皿盖上的冷凝水落入培养 基，造成污染。 (5)若倒平板时，培养基溅在皿盖和皿底之间的部位，这个 平板应丢 弃。 3平板画线操作 (1)第一次画线及每次画线之前都需灼烧接种环进 行灭菌 ，画线操作结束仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表： 第一次灼烧每次画线之前灼烧画线结 束后灼 烧 目 的 避免接种环上 可能存在的 微生物污染 培养物 杀死上次画线结 束 后接种环上残留 的菌种，使每次 画线的菌种来自 上次画线末端 杀死接种环上 残留的菌种 ，避免细菌 污染环境和 感染操作者 (2)灼烧接种环之后，要冷却后才能伸入菌液，以免温度太高 杀死菌种。 (3)画线时 最后一区域不要与第一区域相连。 (4)画线用力要大小适当，防止用力过大将培养基画破。 4稀释涂布平板 (1)稀释操作时：每支试管及其中的9 mL水、移液管均需灭 菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰12 cm处。 (2)涂布平板时： 涂布器用70%酒精消毒，取出时，多余酒精在烧杯中滴尽 ，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃。 不要将过热 的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其 中的酒精。 酒精灯与培养皿距离要合适，移液管头不要接触任何物体 。 热点突破 题型一 果酒、果醋制作原理及过程 典例1 低度的果酒、果醋具有一定的保健养生功能。下图是 两位同学制果酒和果醋时使用的装置。同学甲用A(带盖的 瓶子)装置制葡萄酒，在瓶中加入适量葡萄汁，发酵温度控 制在1825 ，每隔12 h左右将瓶盖拧松一次(注意不是 打开瓶盖)，之后再将瓶盖拧紧。当发酵产生酒精后，再将 瓶盖打开，盖上一层纱布，温度控制在3035 ，进行果 醋的发酵。同学乙用B装置，温度控制与甲相同，不同的 是制果酒阶段除充气口用夹子夹紧外，排气的橡胶管也用 夹子夹住，并且每隔12 h左右松一松夹子放出多余的气体 。制果醋阶段适时向充气口充气。经过20 d左右，两位同 学先后完成了自己的发酵制