半微量凯氏定氮法测定蛋白质含量(一) 方法原理样品与硫酸一同加热消化, 分解有机质, 释放出的 NH3 与硫酸结合成硫酸铵留在溶液中。在定氮消化瓶中,用氢氧化钠中和硫酸铵生成氢氧化铵,加热又分解 NH3 ,用硼酸吸收, 用标定过的盐酸或硫酸滴定, 从而计算出总氮量, 换算为蛋白质量。(二) 仪器、设备1. 仪器分析天平: 感量 0.0001克；实验用粉碎机；半微量凯氏蒸馏装置；半微量滴定管, 容积 10毫升；硬质凯氏烧瓶: 容积 25毫升, 50 毫升；锥形瓶: 容积 150毫升；电炉: 600瓦。2. 试剂(1) 盐酸: 分析纯, 0.02mol/L, 0.05mol/L 标准溶液(邻苯二甲酸氢钾法标定)；(2) 氢氧化钠: 工业用或化学纯, 40%溶液(W/V)；(3) 硼酸: 分析纯, 2%溶液(W/V)；(4) 硼酸混合指示剂: 溴甲酚绿 0.1克, 甲基红 0.1克分别溶于 95%乙醇中,混合后稀至 100毫升, 将混合指示剂与 2%硼酸溶液按 1:100 比例混合, 用稀酸或稀碱调节 PH值为4.5, 使呈灰紫色, 此溶液放置时间不宜过长, 需在 1个月之内使用；(5) 加速剂: 五水合硫酸铜(分析纯)10 克, 硫酸钾(分析纯)100 克在研钵中研磨, 仔细混匀, 过 40目筛；(6) 浓硫酸: 比重 1.84, 无氮；双氧水: 分析纯,30%；蔗糖: 分析纯；(7) 双氧水硫酸混合液(简称混液): 双氧水、硫酸、水的比例为 3:2:1, 即在 100毫升蒸馏水中,慢慢加入 200毫升浓硫酸, 待冷却后, 将其加入 300毫升 30%双氧水, 混匀, 此混液可一次配制 5001000 毫升贮藏于试剂瓶中备用, 夏天最好放入冰箱或阴凉处贮藏, 室温(20)上下时不必冷藏, 贮藏进间不超过 1个月 。(三) 操作步骤1. 样品的选取和制备 选取有代表性的种子(带壳种子需脱壳)挑拣干净, 按四分法缩减取样, 取样量不得少于 20克。将种子放于 6065烘箱中干燥 8小时以上, 用粉碎机磨碎, 95%通过 40目筛, 装入磨口瓶备用。2. 称样 称取 0.1克试样两份(含氮 17 毫克), 精确至 0.0001克, 同时测定试样的水分含量。 3. 消煮 1 将试样置开 25毫升凯氏瓶中, 加入加速剂粉末。除水稻为 1克外, 其它均为 2克。然后加 3毫升硫酸, 轻轻摇动凯氏瓶, 使试样被硫酸湿润, 将凯氏瓶倾斜置于电炉上加热, 开始小火, 待泡沫停止后加大火力, 保持凯氏瓶中的液体连续沸腾, 沸酸在瓶颈中部冷凝回流。待溶液消煮到无微小的碳粒并呈透明的蓝绿色时, 谷类继续消煮 30分钟,豆类继续消煮 60分钟。4. 消煮 2 将试样置于 50毫升凯氏瓶中, 加入 0.5克加速剂和 3毫升混液,在凯氏瓶上放一曲颈小漏斗, 倾斜在电炉上加热, 开始小火(用调压器将电压控制在 175伏左右), 保持凯氏瓶中液体呈微沸状态。5 分钟后加大火力(将电压控制在 200伏左右)。保持凯氏瓶中液体连续沸腾, 消煮总时间, 水稻、高粱为 30分钟, 其它均为 45分钟。注: 消煮中列入两种消煮条件, 经与国际谷物化学协会标准法(ICC)比较, t 值测验均不显著, 准确度与精密度也基本一致,在具体工作中可根据实际情况取其一种。5. 蒸馏 消煮液稍冷却后加少量蒸馏水, 轻轻摇匀。移入半微量蒸馏装置的反应室中,用适量蒸馏水冲洗凯氏瓶 45 次。蒸馏时将冷凝管末端插到盛有 10毫升硼酸指示剂混合液的锥形瓶中, 向反应室中加入 40%氢氧化钠溶液 15毫升(如采用消煮 2的条件, 加 10毫升即可)。然后通气蒸馏, 当馏出液体积约达 50毫升时,降下锥形瓶。使冷凝管末端离开液面, 继续蒸馏 12 分钟, 用蒸馏水冲洗冷凝管末端,洗液均需流入锥形瓶中。6. 滴定 谷类以 0.02mol/L, 豆类以 0.05mol/L标准盐酸或硫酸滴定至锥形瓶中的溶液由蓝绿色变成灰紫色为终点。空白用 0.1克蔗糖代替样品作空白测定。消耗标准酸溶液的体积不得超过 0.3毫升。(四) 结果计算式中:V2 滴定试样时消耗标准酸的体积(毫升)V1 滴定空白时消耗标准酸的体积(毫升)N标准酸溶液的浓度(mol/L)K 氮换算成粗蛋白质的系数W 试样重量(克)X 试样水分含量0.0140每毫摩尔氮的克数平行测定的结果用算术平均值表示,保留小数后二位。两份试样粗蛋白质的平行测定结果为 15%以下时, 其相对相差不得大于 3%；15%30%进为2%；30%以上为 1%。结果必须注明氮换算成粗蛋白质的系数, 换算系数见表(2-1)。表 不同作物种子含氮量换算成粗蛋白之系数 K种 子换 算 系数 麦类、豆类 5.70 水 稻 5.95 高 梁 5.83 大 豆 6.25 其它谷物 6.25