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下载可编辑血小板浓缩制品 血小板作为一种多功能细胞,不仅在血栓形成和止血中发挥作用,而且在血管发生、组织修复和炎症过程中也扮演着重要的角色1。血小板被激活后,可释放多种生物活性物质,在促进组织愈合方面起重要作用。目前的血小板浓缩制品经过几代发展主要有以下几种:富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP),富血小板纤维蛋白(platelet rich fibrin,PRF),浓缩生长因子(CGF,Concentrate Growth Factors)。一 发展历史 1984年,As s o i o n2等发现了人血浆中提取的富血小板血浆(plateletrich plasma,PRP)中含有多种生长因子,当PRP与氯化钙以及牛凝血酶混合后,各种生长因子即从血小板中的颗粒中释放出来。但是牛凝血酶的使用往往伴随着凝血因子、抗体的形成,并且存在着威胁生命的凝血紊乱发生的可能性3。作为第二代浓缩血小板,富血小板纤维蛋白(PRF)是由Choukroun。PRF是富纤维蛋白凝胶,由患者静脉中抽取的新鲜血液制作而成,属于新一代的血小板浓缩物,它制备简单无需任何生物添加剂的处理。在PRF通过离心分离的制备过程中,血小板被激活同时大量脱颗粒细胞中蕴含的重要的生长因子释放出来4。浓缩生长因子(CGF)是Sacco首先研发的5,与PRF一样,CGF由静脉血分离制备而成。不过,两项技术的离心速度有所不同。与PRF不同,CGF技术采用的速度从2400到2700rpm不等,这是为了分离静脉血中的细胞,因此CGF中富含纤维蛋白凝块比PRF中的大得多,而且更粘稠,纤维蛋白的含量也更多。二 详细介绍1 PRP1.1 PRP 制取方法及组成结构 PRP 最早由 Assoian 于 1984 年提取制备2,是自身静脉血经梯度离心分层后位于白细胞上方的富含血小板的血浆部分,含有全血中 70%以上的血小板,于其中加入凝结剂(常用 10%氯化钙和凝血酶)可形成胶状物,激活后血小板 颗粒释放出多种生长因子,如转化生长因子-(TGF-)、骨形成蛋白(BMPs)、血小板衍生生长因子(PDGF)、类胰岛素生长因子(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)等6-8。这些生长因子在 PRP 中浓度很高,根据不同的制作方法,约为体内正常浓度的几倍甚至几百倍9-11。PRP 血浆成分中的纤维素,纤连蛋白及亲玻粘连蛋白,可作为生长因子的载体,同时也是一种非常良好的细胞黏附分子。1.2 PRP 的现状 在过去的20余年间,PRP已经逐渐被应用于临床,其中包括促进软组织愈合和促进骨组织再生方面的应用。应用较多的领域主要有整形美容和创伤外科专业等12,13。1998年PRP由Marx首次引入口腔医学领域中,并逐渐成为口腔医学的研究热点之一。其中PRP在口腔种植学骨增量方面相关的研究进行的较多,并且得到了多数的肯定。但是,PRP的应用一直争议不断,这些争议集中于其疗效的稳定性14-19和使用的安全性上。后者的矛盾最为尖锐。此矛盾的产生源于PRP在制备过程中需要加入异种凝血酶和抗凝血制品,这被认为可能导致免疫排斥反应的发生和感染性疾病的传播。2 PRF2.1 PRF 制取方法及组成结构 为了延续PRP的优势,同时避免争议,法国科学家Choukroun等于2000年提取制备了新一代自体血液制品Choukroun富血小板纤维蛋白(Choukroun platelet-rich fibrin,Choukrouns PRF)20。Choukrouns PRF 是自身静脉血经离心分层后位于贫血小板血浆层(Platelet poor plasma,PPP)与红细胞碎片层之间的富含血小板的纤维蛋白凝胶。在制备过程中,Choukrouns PRF 的纤维蛋白原发生缓慢的聚合,形成三分子的立体网状结构,其凝胶组织具有疏松、孔隙大、弹性好,滞留大量血小板及生长因子的特点。传统的 PRP 为四分子结构,而 PRF 经过缓慢自然的聚合,产生的纤维蛋白为三分子立体网状结构,其凝胶组织较为疏松,孔隙大,弹性高。组织细胞及循环血中的干细胞能更快的长入其中,细胞因子也被大量的滞纳,并与纤维蛋白发生化学键结合。PRF 的纤维蛋白作为一种基质为细胞的附着,迁移以及分化提供了有利的场所22。生长因子主要包括转化生长因子-(Transforming growth factor-,TGF-)、血小板衍生生长因子-AB(platelet-derived growth factor-AB,PDGF-AB)、类胰岛素生长因子-(insulin-likegrowth factor-,IGF-)等。由于 Choukrouns PRF 纤维蛋白原发生缓慢聚,使血小板和生长因子以化学键结合于 PRF 的纤维蛋白原上,利于其充分发挥协同作用21。纤维蛋白基质内还含有大量的免疫细胞,可能参与炎症反应的调节。2.2 Choukrouns PRF 促进骨组织再生的机制、机理 Choukrouns PRF 作用的发挥有赖于其富含血小板内的- 颗粒脱颗粒后释放的多种生长因子。生长因子可以诱导成骨细胞迁移、增殖、分化,促进骨愈合。Choukrouns PRF 内还富含散在的免疫细胞,这些免疫细胞可以释放多种炎症因子,可能参与炎症调节,从而减轻周围软组织的炎症反应,同时具有抗感染能力。Dohan 等提出Choukrouns PRF 不仅含有大量血小板,而且可以加强机体的防御反应23。在制备 Choukrouns PRF 过程中,采集的血液中未添加抗凝剂,也未使用凝血酶和氯化钙诱导血小板活化及纤维蛋白聚合,模拟生理性的凝血过程,发生了类似天然纤维蛋白网形成的缓慢聚合,形成三分子立体网状结构24。这种网状结构便于营养物质和氧气弥散至细胞周围,为成骨细胞的迁移、增殖及分化提供场所;网状结构还可以为骨愈合提供支架。与 PRP 相比,Choukrouns PRF 具有更强的成骨能力。Ling He 等研究认为Choukrouns PRF 具有逐步释放生长因子的生物特性,并使其保持较高水平25,从而表现更优越的成骨作用。孙洁等研究显示 Choukrouns PRF 内大部分血小板外膜完整,大量 - 颗粒完整未破裂,从而证明 PRF 内大量血小板仍处于未完全激活状态26。同时,Dohan DM 等研究认为 PRF 的网状结构将血小板、生长因子以化学键结合24。因此,随着纤维蛋白逐渐溶解,结合的生长因子缓慢释放,同时结合的血小板被激活后脱颗粒释放出生长因子,使生长因子持续发挥作用,延长了生长因子的作用时间,加强了成骨效果。还有研究提出,Choukrouns PRF 内的大量免疫细胞也可以使 ChoukrounsPRF 内释放的 TGF- 和 VEGF 在实验过程中始终保持较高水平27。上述研究证实Choukrouns PRF 具有良好的成骨能力。2.3 PRF 促进软组织愈合影响的作用原理 首先,PRF 富含的多种生长因子可协同作用,促进型胶原及纤连蛋白的合成,促进基质干细胞的趋化及增殖,刺激成纤维细胞及血管内皮的分化增殖29,在组织愈合过程中起重要调控作用。 其次,PRF 的三维立体网状结构作为基质,为细胞的附着,迁移以及分化提供了有利的场所28,使组织细胞及循环血中的干细胞能更快的长入其中,并且,这种结构弹性好,孔隙大,利于营养物质及氧气的弥散,加速愈合过程。 第三,大量的滞纳的血小板及生长因子与纤维蛋白发生化学键结合,这种特殊的结构与多种生长因子有较强的亲和力,从而使生长因子缓慢释放,延长 PRF 在创口的作用时间30。也有研究表明,PRF 的立体结构可以滞纳大部分白细胞,调节炎症反应,并使多种细胞因子缓慢持续释放,对于组织修复产生积极效果31-33。2.4 Choukrouns PRF的突出特点: 制备操作简单;制备过程无需添加抗凝试剂及凝血酶制品,种植手术术前术中均可进行,不存在交叉感染危险34,使用安全;完全取自自体血,经济方便;制备过程模拟天然凝血过程,制得的纤维蛋白凝胶分子结构类似于天然血凝块中的纤维蛋白;富含血小板及各种细胞因子,具有促进组织愈合的能力;含有免疫细胞释放的炎症因子和修复介质,具有调节炎症反应和抗感染的能力35。 在制备上,其突出之处在于不添加任何生物制剂,只需简单的离心,这就避免了以往血液制品存在的伦理道德争议和疾病传播的风险。 在生物性能上,其突出之处在于富含具有调节组织修复能力的血小板及其活化后释放的多种细胞因子36,如转化生长因子(transforming growthf actor-1,TGF-1),血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor-AB,PDGF-AB),血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)以及胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor-,IGF-),这些生长因子可以有效的调控成骨细胞,成纤维细胞等与组织修复紧密相关的细胞的增殖、分化以及凋亡37-40。 最值得关注的是,由于Choukrouns PRF的制备过程促发纤维蛋白的缓慢聚合,使得其内的各种细胞因子有充分的时间和条件与纤维蛋白分子发生化学键结合,以及发挥相互的协同作用41,这将大大减少细胞因子的流失,加强其生物学功能。 由于Choukrouns PRF生物学功能的发挥有赖于其特殊的分子结构,因此,分子结构也是其突出特点之一。Choukrouns PRF的纤维蛋白聚合过程为缓慢自然的聚合,产生的纤维蛋白分子为三分子结构,呈立体网状,形成的凝胶较为疏松,具有较大的孔隙及良好的弹性。这是Choukrouns PRF不同于PRP的显著特点。由于PRP为人工加入的凝血酶促发的纤维蛋白聚合,聚合速度快。因此产生的纤维蛋白为四分子结构,较为致密,不利于细胞因子的滞纳和细胞的长入。2.5 小结 Choukrouns PRF 用于口腔种植领域具有以下优势:1、完全取自自体血,未加入任何人工生物制品,既避免了伦理道德的争议,又避免了血液交叉感染的风险;2、富含大量血小板、生长因子,具有促进骨组织再生的功能;3、富含大量免疫细胞,可以减轻组织愈合过程中的炎症反应及具有抗感染能力;4、Choukrouns PRF 形成的网状结构利于成骨细胞迁移,增殖及分化,充分发挥生长因子的作用,同时为组织愈合提供支架;5、制备过程简单,便于操作。3 CGF3.1 CGF的制备方法 浓缩生长因子(CGF)是Sacco首先研发的5,与PRF一样,CGF由静脉血分离制备而成。不过,两项技术的离心速度有所不同。首先采集10ml患者的静脉血,注入试管中,注满后勿摇动,立即放入Medifuge(Silfradent 意大利)离心加速机的转筒中。设定制备CGF程序,旋转12分钟后,可见试管中分为三层(最上层为血清,中间纤维蛋白层,底层为红细胞及血小板),将血清分离出来,并存储在特定的存储器皿中。CGF被分离出来,并存储在稀释的抗菌溶液中(Lincocin 600mg)。底层的红细胞部分及血小板立即存储在器皿中,其中富含红细胞、血小板以及铁、钙和其他基本元素、可以用来制备截骨术中的填料,以便混合生物材料及自体骨。将CGF切割成1-2mm的微粒,随后依次与收集的红细胞部分和骨代材料混合,为增加混合物的柔软度,可添加一些血清。使用特定的收集设备(Silfradent 意大利)旋转6秒钟左右将其混合并搅匀,将这种密度大的糊状粘结剂嵌入骨缺损处。另外CGF具有极大的可模制
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