附件3人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型、试剂技术审查指导原则本指导原则旨在指导注册申请人对人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。本指导原则是针对人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导性文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。一、范围人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV）属于乳头瘤病毒科，是一种小分子的、无被膜包被的1、环状双链DNA病毒，基因组长约8000碱基对（bp），分为3个功能区，即早期转录区（E区）、晚期转录区（L区）和非转录区（长控制区，LCR）。HPV通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。该病毒不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性，只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣及生殖道上皮增生性损伤。对于感染生殖道和肛门的HPV，根据各基因型别致病力大小或致癌危险性大小可分为低危型和高危型两大类。在有性生活史的女性中生殖道HPV感染具有普遍性，据统计70%80%的女性在其一生中会有至少一次的HPV感染，但大多数感染为自限性，超过90的感染的女性会出现一种有效的免疫应答，在没有任何长期的健康干预时在6到24个月之间可以清除感染。而持续性的高危型HPV感染则是导致宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的主要原因。全球范围的研究结果显示，在99.7%的宫颈癌患者体内检测到高危型HPV DNA的存在，其中HPV16型、18型、45型和31型感染占80%。低危型HPV一般与尖锐湿疣或低度鳞状上皮内病变相关，极少引起浸润癌。关于高危型与低危型的划分，国际上许多机构都给出了参考建议，依据WHO国际癌症研究机构（IARC）及其他国际组织的研究成果，本指导原则建议将HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13种基因型列为高危型别，26、53、66、73、82等5种基因型列为中等风险型别，本指导原则中所述的检测试剂及其要求均只针对用于宫颈癌相关预期用途的（上述18种）HPV基因型核酸检测，如申报的宫颈癌相关HPV核酸检测产品涉及上述18种型别以外的其他HPV基因型，则申请人需提出明确的理由和依据，且应得到国际有关权威机构的文献支持。下文中述及“高危型”均泛指此18种HPV基因型。多年来，国际上通用的宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的诊断主要遵循“三阶梯式”诊断程序，即宫颈细胞学、阴道镜及组织病理学检查。宫颈细胞学检查是普遍应用的宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的筛查方法，可发现早期病变。但宫颈细胞学检查存在其固有的局限性。高危型HPV检测用于宫颈细胞学检查异常患者的分流及宫颈癌筛查，可有效地增加宫颈病变检出率，提高细胞学检查敏感性，并降低筛查频率。本文所述人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型试剂是指利用包括PCR-荧光探针法或其他分子生物学方法在内的核酸检测技术，以特定高危型HPV核酸（包括DNA和RNA）序列为检测目的，对人宫颈样本(如人宫颈脱落上皮细胞或分泌物等)进行体外定性检测的试剂，以确定受试样本中是否存在高于阳性判断值水平的高危型HPV病毒，或同时鉴定感染HPV的基因型别。此类试剂在临床上用于：1）筛查宫颈细胞学检查为ASC-US（意义未确定的非典型鳞状上皮细胞）结果的患者，以确定是否需要进行阴道镜检查（以下简称ASC-US人群分流用途）；2）对于30岁及以上的女性，通过检测是否有高危型HPV感染，与宫颈细胞学检查联合进行宫颈癌筛查，此检测结合细胞学病史和其他风险因素的评估、以及临床诊疗和筛查指南的要求，用于指导患者的管理(以下简称宫颈癌联合筛查用途)；3）对于某年龄段（根据临床试验结果而定）女性，通过检测是否有高危型HPV感染，进行宫颈癌筛查，此检测结合细胞学病史和其他风险因素的评估、以及临床诊疗和筛查指南的要求，用于指导患者的管理（以下简称宫颈癌初筛用途）。除此以外，若申请人提出其他的预期用途，则应详细描述相关的临床背景信息和该检测与临床用途的相关性，并在临床试验中充分验证相关的临床意义。本指导原则仅针对上述三种预期用途提出相关要求。这里所述的HPV核酸检测试剂是指可同时检测多种基因型HPV但不能对阳性结果进行基因分型的试剂，HPV基因分型试剂是指检测多种基因型HPV的同时可以对HPV阳性结果进行基因分型的试剂。关于本指导原则所述产品的预期用途还有以下几点需要强调。第一，在年龄30岁的女性中，虽然HPV感染率很高，但其自主清除率也很高，因此对于细胞学检查正常的受试者不建议再采用HPV检测做联合筛查，在经过临床试验证实的基础上亦可直接采用HPV检测作为初筛方法；此类HPV核酸检测试剂对不同年龄段人群的适用情况应符合相关宫颈癌筛查指南的要求。第二，HPV核酸检测试剂用于ASC-US人群分流或宫颈癌筛查时，其可覆盖的HPV基因型别应至少包含16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型（共13种），亦可同时包含26、53、66、73、82型中的一个或数个型别；根据现有的研究成果，若可检测的HPV基因型别不能涵盖上述13种高危型，则可能造成阴性预期值无法达到临床要求，因此不建议单独用于上述预期用途。对于基因分型试剂，目前的研究数据已证实16、18型的基因分型检测用于辅助（宫颈癌筛查中）HPV核酸检测阳性结果的分析，是有临床意义的，可以进行注册申请，申请人应合理陈述预期用途，其性能评估和临床试验中适用于本指导原则的部分应参照执行；但应注意：并非所有HPV基因型的分型检测均有确定的临床意义，申请人在研发HPV基因分型检测试剂时应以临床研究结果为基础，而不应盲目扩大分型范围。第三，低危型HPV一般与尖锐湿疣或低度鳞状上皮内病变相关，但其检测的临床价值尚不明确，若申请人提出相关产品注册，则应详细解释其临床意义和适应症，并提供充分的证据。第四，鉴于此类试剂的样本采集方法不利于量值溯源，无法保证定量检测结果的准确性，因此建议检测试剂定位为定性检测，本指导原则不适用于进行定量或半定量HPV核酸检测试剂的注册；最后，本指导原则只针对与宫颈上皮内瘤变及宫颈癌相关的高危型HPV检测，不适用于除宫颈样本外其他样本类型的检测。本指导原则适用的检测方法主要指基于核酸检测的分子生物学技术。现有HPV核酸检测技术主要包括杂交捕获法、酶切信号放大法、PCR-荧光探针法、转录介导的核酸扩增技术以及PCR-杂交法等。这些方法在性能评价上可能会略有差异，但在技术指标方面均适用于本指导原则，以下有关注册申报资料的要求主要针对PCR-荧光探针法提出，其他方法学试剂应针对产品自身特点进行相应补充或修正。由于宫颈癌筛查涉及面广，故由假阴性和假阳性HPV检测结果引起的潜在公共卫生损害风险较为显著。假阴性结果可能导致宫颈癌诊断和治疗不及时，假阳性结果可能导致不必要的频繁筛查和侵袭性处置。因此，确立良好的性能指标并充分理解HPV检测的临床意义，对于此类产品的安全有效性评价至关重要。产品性能如不符合临床需求，可能导致对患者所作的决策错误。总体来说，此类试剂分析及临床性能的评价应有严格的控制，同时亦应重点关注临床的合理应用和检测结果的科学解释。本指导原则仅包括对人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测及基因分型试剂注册申报资料中部分项目的要求，适用于进行产品注册和相关许可事项变更的产品。其他未尽事宜（包括产品风险分析资料等），应当符合体外诊断试剂注册管理办法（总局令第5号）（以下简称办法）等相关法规和文件的要求。二、注册申报资料要求（一）综述资料此类产品的综述资料中，与预期用途相关的临床适应征背景情况的描述应着重于高危型HPV核酸检测和宫颈癌之间的相关性，及HPV检测临床应用的限定要求，陈述应科学、客观且有依据。与国内外同类产品的比较内容应着重从方法学及HPV基因型检出能力等方面进行比较。综述资料的撰写应符合办法和体外诊断试剂注册申报资料要求及说明（总局公告2014年第44号）（以下简称44号公告）的相关要求。（二）主要原材料研究资料此类产品的主要原材料包括引物、探针、酶、dNTP、核酸分离/纯化组分（如有）及企业参考品、试剂盒对照品（质控品）等。应提供主要原材料的选择与来源、制备及质量标准等的研究资料、对照品（质控品）的定值试验资料等。1.引物和探针：应详述引物和探针的设计原则，提供引物、探针核酸序列、模板核酸序列及两者的对应情况。建议设计两套或多套引物、探针以供筛选，针对所有预期适用的HPV基因型别进行检出能力和特异性（如交叉反应）的评价，选择最佳组合，并提交筛选的研究数据。引物、探针的质量标准应至少包括纯度检查、浓度检查及功能性实验等。2.酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶，其质量标准应包括DNA聚合酶活性、核酸内切酶活性、热启动能力、热稳定性等；还可能涉及尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG）和逆转录酶，亦应分别对其酶活性等进行评价和验证。3. dNTP：质量标准应至少包括纯度检查及功能性实验等。4.若主要原材料为企业自己生产，其生产工艺必须相对稳定，并提交生产工艺验证报告；如主要原材料购自其他供应商，则需针对供应商的选择提供评价数据，并提供供应商出具的质量标准、出厂检定报告，以及申请人对该原材料进行的质量检验资料。5.企业参考品：应详细说明有关企业参考品的原料选择、制备、定值过程等试验资料。企业参考品的核酸性质（DNA或RNA）应与产品预期检测的靶物质一致。鉴于HPV病毒尚不能体外培养，企业参考品可采用感染HPV的细胞系，也可采用人工克隆或合成的HPV基因组DNA（或转录RNA）等。具体要求如下：5.1阳性参考品和阴性参考品无论试剂盒能否进行HPV基因分型，阳性参考品均应针对所有适用的HPV基因型分别设置。阴性参考品应考虑检测特异性的评价，适当纳入其他HPV基因型样品和其他病原体样品。5.2 检测限参考品可选择检测限浓度或略高于检测限浓度，并针对不同基因型分别设置。5.3 精密度参考品可不包含所有涉及的HPV基因型，但应选择临床较常见的或风险程度较高的基因型（至少包含16或18型），并至少设置一个弱阳性水平。6.试剂盒对照品（质控品）试剂盒的质控体系通过设置各种试剂盒对照品（质控品）来实现。阳性对照品（质控品）的核酸性质应与待测样本的靶核酸性质一致，如同为DNA或RNA，其中可不包含所有涉及的HPV基因型，但应选择临床较常见的或风险程度较高的基因型，并至少包含16或18型。阴性对照品（质控品）应参与样本处理和检测的全过程，如核酸的平行提取等步骤。企业应对阳性对照品（质控品）的检测结果（如Ct值）做出明确的范围要求。内对照（内标）可以对管内抑制导致的假阴性结果进行质量控制，申请人应对内对照（内标）的引物、探针设计和模板浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线又要尽量降低对靶基因检测造成的抑制。对内对照的检测结果（如Ct值）亦应做出明确的范围要求。（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料1.介绍产品主要生产工艺，可以图表方式表示，并说明主要生产工艺的确定依据。2.反应原理介绍。3.详述样本收集液、样本处理方式的选择和设置，提供相关的研究资料。4.确定最佳反应体系的研究资料，包括酶浓度、引物/探针浓度、dNTP浓度、阳离子浓度及反应各