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组织切片各个步骤中经常遇见的问题和克服策略摘要:据统计,常规的组织切片实验要历经9个步骤,每个步骤又分为220个小步骤,整个实验完成需四个步骤以上。本文就组织切片染色各个步骤中常见问题及解决方法进行概括总结,与同道中人共勉之。据统计,常规的组织切片实验要历经9个步骤,每个步骤又分为220个小步骤,整个实验完成需四个步骤以上。本文就组织切片染色各个步骤中常见问题及解决方法进行概括总结,与同道中人共勉之。常规组织切片的制作过程较繁琐,按具体制作效能分为固定、取材、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色、封片等九大步骤。其中脱水有12 个步骤、透明有2 个步骤、浸蜡有3 个步骤、染色有23 个步骤,一般要经过总计4045 个步骤,各个实验室根据自身的实际情况及工作习惯各有不同。1 固定和取材组织切片的固定剂主要为甲醛和酒精,固定剂可与蛋白质交联结合、使之变性,组织硬化、结构固定,此外其本身的变性物质可与染料结合,增强着色能力。同时,固定交联和沉淀蛋白质、脂肪、糖、酶等细胞内物质成分,产生不同的折光率,使得光学显微镜下易于更清晰地观察组织细胞的微细结构。1.1 减少或去除组织切片中甲醛颗粒甲醛饱和液偏酸,影响细胞核的染色,特别是放置较久后,易析出沉积在组织切片中,呈细小的黑褐色或黄黑色颗粒物,影响观察。以甲醛饱和液和pH7.2 的PBS 缓冲液配制的10%中性甲醛固定液( 体积比为19) 应用最普遍,效果也相对较好,可以减少和消除甲醛颗粒。如果现场无法配制PBS 缓冲液,可在固定溶液中加入一些普通白粉笔,使溶液呈中性或弱碱性。甲醛颗粒易于出现在血液和血浆分布区,以及自然腐败较重的组织,可作为组织出血和血浆渗出指示剂。1.2 防止组织固定不良固定液过浓或过稀释,渗透组织的能力就差,组织固定不均匀,出现中央区组织固定不良。不仅取材时,组织软硬不均,切面不平整,影响切片时修平组织观察面,组织固定不良还会影响脱水、浸蜡、染色等效果( 表1) 。一般固定液与检材体积比为110 左右为宜,器官组织完全浸泡于固定液中,固定时间37 d。自溶腐败严重组织检材固定时间应适当延长几天,或增加固定液中甲醛浓度( 可按18 比例配制) 。环境寒冷时,亦应适当增加固定液浓度。固定液每天浸透组织约23mm,为快速完全固定组织检材,脑、肝、肺、心、肾、脾等较大器官,均应切开后再固定。全脑应线绳悬吊固定( 普通病理检验,先正中矢状切开胼胝体后固定,可加速全脑固定) ,心应常规切开各房室腔,肺和肾应分别从最大外缘向肺门和肾门正中切一刀,肝、脾常规平行长轴切成23 cm厚片,再予固定。如果固定的器官较大、容器较小或固定液较少时,应于固定3 d 内,翻动器官或更换固定液,以免大器官贴壁面压平和固定不良。1.3 避免组织切片厚薄不均和不规则腔隙取材一般在解剖之后37 d 进行,取材时要刀快手稳,切面平整,厚度35mm,避免组织块厚薄不均、观察面不平整,检材组织块大小应略小于所选用的盖玻片12mm,以便封胶完全。组织块记号纸应为70 g以上的复印纸,必须碳素笔标记,以免笔迹被脱水透明掉。组织块应流动自来水充分冲洗12 h 以上,尽量洗掉和稀释残留的甲醛溶质和颗粒。2 脱水、透明、浸蜡和包埋2.1 脱水和透明脱水和透明是影响切片质量的重要环节,要保证脱水的彻底而又不过度。首先要保证梯度酒精试剂的浓度、容量,要及时更换。脱水不彻底导致透明时无法置换组织中水分,浸蜡不完全,切片时组织中间出现松软空洞,摊片时切片容易散开,染色时易于脱片、着色不良,蜡块缩水。脱水时要根据不同的组织、大小、年龄,以及动物的标本,调整各步时间。由于丙酮易挥发,要经常更换,以保持浓度。脱水过度组织块变硬,切片时易于碎裂。2.2 浸蜡第一缸石蜡中加入少量二甲苯或低熔点软蜡,最后一缸浸蜡和包埋的石蜡的熔点要相同,不然组织与石蜡不能紧密结合,摊片时易解离。浸蜡的时间不宜过长,否则易造成组织块脆硬,切片如豆腐渣样。2.3 包埋包埋的石蜡应预先溶解一段时间,以保证石蜡密度均匀,初熔石蜡中含有杂质,应去除沉淀或絮状杂质,保证石蜡干净、致密,利于切片。应根据不同的季节调整包埋蜡的熔点,冬季用5658 低熔点蜡,夏秋季用6062 高熔点蜡。包埋时蜡缸温度不超过70 ,防止石蜡挥发,污染环境。3 切片、摊片、烤片3.1 切片环境温度高时,切片前可将蜡块放入冰箱冷藏柜预冷30min。刚包埋好的热蜡块不能立刻冷冻,速冷会造成蜡块裂痕,组织块易碎。在刀架上放置组织蜡块时,应注意组织块包埋方向、组织层次等,使纤维和肌肉走向与切片刀刃平行,较难切的组织部分应放在上面,如皮肤表皮、包膜、胃肠道浆膜等,以减少组织断裂现象。操作切片机时应用力均匀,避免用力过重。脱钙的组织、骨髓,以及钙化组织,应选用固定刀口,以减少刀刃过多的缺口。用毛笔展片时,要防止笔丝进入刀口,以免增加刀刃缺口。为了减少刀片损耗,修片时用已经旧刀片,切片时用新刀片,保持新刀片刃锋利、不粘蜡,避免切片皱褶和刀痕。刀刃有缺口时,切片出现豁口,刀刃钝时,切片皱褶、易碎,应及时更换刀口位置或刀片。蜡块夹不紧或刀片变钝时,易跳刀,应重新调整夹板或更换刀片。切片时,动作要轻柔,用力均匀,避免切片厚薄不均。每切一个蜡块都应该把切片刀和刀架的碎片都清理干净,避免组织间的相互污染。如遇难切的蜡片时,可用与蜡块切面大小相仿的薄纸潮湿后贴蜡块表面上切片,然后将附有切片一面朝上放入水中漂片。切片不完整、皱缩或卷片,可能刀不快或切片角度不对,一旦调准最佳切片角度和磨刀角度( 传统的大切片刀) 后不要随意改变。3.2 摊片摊片的水温一般为4045 。摊片时动作要匀速轻柔,避免皱褶和产生气泡。水温过高时,切片易离散。出现小气泡时,可用眼科镊尖端在水下小心地移除气泡,以减少脱片和组织破损的机会。室温低时,捞片时将载玻片放入水中片刻,防止切片褶皱而导致脱片。3.3 烤片烤片温度应为70左右,烤片时间不少于30min。温度过高和时间太长,组织易干固、皱缩,折光增强。4 染色、封片、归档染色过程中,首先应保证各种试剂的浓度、体积,不能有沉淀。用Harris 苏木精液时,染色前要先用一张滤纸除去液体表面的结晶,以免污染切片。脱蜡彻底,不然易出现嗜碱性片状模糊,毛玻璃样现象,染色不均。严格控制酒精梯度时间,以免水分过快进入细胞,破坏细胞结构,影响染色效果。染色时调节pH 值很重要,在甲醛溶液中固定时间长的组织块,组织酸化而影响细胞核着色,故应自来水冲洗时间长一些或在稀氨水中处理12min,以使细胞核着色较深4。胞浆伊红着色不佳时,可在伊红溶液中滴加12滴冰醋酸。脱蜡之后,在无水乙醇中时间要足够长,以完全洗去二甲苯。严格控制分化时间,最好在显微镜下观察分化效果,一般以细胞核染色清晰而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅,应重新染色后再行分色。盐酸酒精分化之后冲水时间不少于5min,尽可能洗去胞质中苏木素染液,增强返蓝效果,使背景不遗留过多染色。染色过程中不要让切片干枯,以免切片收缩、变形,影响细胞形态。切片经酒精脱水后,入二甲苯时出现白色不透明状态,脱水不彻底,应更换酒精、二甲苯,将切片退回无水酒精,重新彻底脱水与透明。透明完全的切片显得干净、透亮便于观察。封片树胶浓度要适中,过稀易出现大气泡、溢胶污染切片,影响观片。过稠易出现后薄不均、折光差,及细小气泡。封固过程中,最好直接从二甲苯中取出封片,保持二甲苯不挥发,避免组织大片破裂。切片封固后应放置一段时间,树胶完固后,才能归档,以免溢胶切片相互粘连重叠。根据环境温湿度,一般应放置715 d。归档切片应放置干燥避光处,避免切片褪色。5 结语完成一个理想的组织切片需要不少的步骤和心血,只有以上一道工序是下一道工序的客户的心态,从容仔细尽心负责地做好每一环节,才能最终摘取到成功的果实。最后希望大家实验顺利。
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