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附录A (资料性附录)梨枯梢病菌PCR检测程序A.1 DNA提取挑取少量分离到的病原菌配制成108CFU/mL悬浮液,1 mL菌悬液按照市售DNA提取试剂盒要求提取DNA。提取后用蛋白/核酸分析仪鉴定DNA质量,当A260/A280比值为1.82.0时,适合于PCR扩增。A.2 引物上游引物(HrcCF):5-GACGTTTGCACCTGGAAACCG-3;下游引物(HrcCR):5-GCGGTAGGTAATCAAGGCCAC-3;扩增产物为476 bp。A.3 反应体系见表E.1.反应组成体积,L10PCR buffer525 mm MgCl2325 mm dNTP2引物(20 m)15 U/L Taq DNA聚合酶0.5模板DNA2ddH2O34总体积50A.4 反应条件94变性3 min;进入循环,94变性30 s,62退火30 s,72延伸30 s,30个循环;最后72延伸5 min。如采用市售的试剂盒,按照说明作适当调整。A.5 电泳分析取5 L PCR扩增产物与1 L的6上样缓冲液混合均匀,上样于1.5%琼脂糖凝胶中,80 V电泳1 h,溴化乙锭(EB)染色20 min30 min后,凝胶成像系统中观察,记录观察结果。
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