1caspase3 抑制剂对肾缺血再灌注损伤的保护作用作者：王占坤 孙立江 李旭东 【摘要 】 目的 观察 caspase3 抑制剂对缺血再灌注损伤肾脏的保护作用，并探讨其作用机制。方法 建立小鼠肾缺血再灌注模型，将实验动物随机分为 3 组：假手术组、缺血再灌注组、治疗组(各 10 只)。治疗组小鼠给予 AcDEVDCHO （4 g/g）0.3 mL，缺血再灌注组再灌注时给予 0.3 mL 含体积分数 0.01 DMSO的生理盐水，假手术组不夹闭肾蒂，余处理同缺血再灌注组。分别检测各组血肌酐(Cr)含量、尿素氮(BUN)含量、细胞凋亡指数（ AI） 、caspase3 活性、髓过氧化物酶(MPO)活性、黏附分子1（ICAM1 ）表达指数。结果 治疗组与缺血再灌注组比较，血Cr 和 BUN 均明显降低， caspase3 活性受到明显抑制，AI 明显下降，MPO 活性显著降低，ICAM1 表达明显减少，差异均有显著性（F=36.10574.13,P0.05） 。结论 AcDEVDCHO 通过抑制细胞凋亡及炎症反应减轻肾脏缺血再灌注损伤。 【关键词】 肾 再灌注损伤 半胱氨酸内肽酶类 细胞凋亡 ABSTRACT Objective To study the protection and its mechanisms of caspase3 inhibitor on renal ischemiareperfusion injury. Methods A renal ischemiareperfusion model was made in 30 rats, which were 2evenly divided into three groups, i.e. shamoperation group (SO group), ischemiareperfusion (IR group), and AcDEVDCHO group (treated group). AcDEVDCHO was given to treated group; normal saline, 0.3 mL, to IR group while reperfusion being done; for SO group, no renal pedicles were clamped. The myeloperoxidase (MPO) and caspase3 activity, blood urea nitrogen(BUN) and creatinine (Cr), renal cell apoptosis index (AI), expression of intercellular adhesion molecule1 (ICAM1) in each group were detected. Results A comparison between treated group and IR group showed that for treated group, the levels of Cr and BUN were both decreased, the activity of caspase3 and MPO were inhibited, the AI decreased, and the index of ICAM1 expression decreased (F=36.10-574.13,P0.05). The differences of the above items were of statistically significant. Conclusion caspase3 inhibitor AcDEVDCHO lessens reperfusion injury of the kidney via inhibition of cell apoptosis and inflammatory reaction. KEY WORDS Kidney; Reperfusion injury; Cysteine endopeptidases; Apoptosis 3急性肾脏缺血 再灌注(I/R)损伤是休克、严重创伤及肾移植过程中一种常见的临床病理生理现象，可以导致急性肾衰竭(ARF)和移植肾功能丧失。因此，如何保护肾脏免受 I/R 损伤，具有重要的临床意义。肾 I/R 损伤机制复杂，有研究表明，细胞凋亡在这一过程中起重要作用1。天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(caspase)是参与调节和执行细胞凋亡最重要的蛋白酶类2，其中 caspase3 是各种凋亡通路的必经之路，在细胞凋亡中起关键性作用3。徐强等4研究结果证实，应用 caspase3 抑制剂（AcDEVDCHO ）不仅能抑制 I/R 心肌细胞凋亡而且减少了炎症反应，对损伤的心肌起到保护作用。但其是否对 I/R 肾脏有相似作用尚未见报道。本实验通过建立小鼠肾脏 I/R 模型，观察 caspase3 抑制剂对 I/R 损伤肾脏的保护作用并探讨其作用机制。 1 材料与方法 1.1 试剂 AcDEVDCHO(Promega 公司, 用前将其溶于 3 L DMSO中，后用生理盐水稀释成 0.3 mL)，尿素氮（BUN ） 、肌酐（Cr）检测试剂盒(南京建成公司) ，TUNEL 试剂盒(Roche 公司)，caspase3 检测试剂盒（Promega 公司） ，髓过氧化物酶（MPO）检测试剂盒(南京建成公司) ，PowerVisionTM 免疫组化检测试剂盒（北京中山生物技术有限公司） 。 1.2 动物及分组 4健康雄性昆明小鼠 30 只，体质量 2025 g（购自青岛市动物中心） 。随机分为 3 组：假手术组、缺血再灌注组、治疗组，各10 只。 1.3 实验方法 1.3.1 动物模型的制备 参照李广宇等 5所介绍方法，用 35 g/L 水合氯醛 0.01 mL/g 腹腔注射麻醉小鼠后，沿腹正中纵轴线做0.81.0 cm 的切口，首先切除右肾，然后钝性分离左肾包膜，用无创动脉夹钳夹左肾蒂 45 min，造成肾缺血，然后松开血管夹，数分钟内肾脏颜色由缺血时的紫黑色转为红色，表示肾缺血再灌注模型建立成功。分二层关闭切口。为维持小鼠体液平衡，用 1 mL 预热的(37 )生理盐水皮下注射。在再灌注后 12 h 处死小鼠，摘眼球采血，切取左肾备用。 1.3.2 用药方法 治疗组小鼠给予 AcDEVDCHO，4 g/g；缺血再灌注组再灌注时予 0.3 mL 含体积分数 0.01 DMSO的生理盐水；假手术组不夹闭肾蒂，余处理同缺血再灌注组。 1.4 检测指标及方法 1.4.1 血 BUN 和 Cr 含量的测定 于再灌注 12 h 后摘眼球取血约 1 mL，用酶法和苦味酸法分别检测 BUN 及 Cr 值。 1.4.2 细胞凋亡率测定 制作肾脏石蜡切片，常规二甲苯脱蜡，采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的原位末端标记法(TUNEL) 测定细胞凋亡率，按检测试剂盒说明书操作。光镜下观察，细胞核呈5棕黄色者为凋亡细胞，于凋亡细胞分布区域，随机选取 5 个视野，400 倍光镜下计数凋亡细胞，以肾小管上皮细胞凋亡阳性细胞数占总肾小管上皮细胞细胞数的百分比作为肾小管上皮细胞凋亡指数（AI） 。AI(%)= 阳性细胞数 /视野所有细胞总数100%。 1.4.3 肾组织 caspase3 活性测定 用预冷的组织裂解液( 含有 25 mmol/L Hepes、5 mmol/L MgCl2、2 mmol/L DTT、5 mmol/L EDTA、体积分数 0.001 Triton X100)裂解新鲜肾组织。4 13 000 r/min 离心 20 min，取上清，比色法测定 caspase3活性，按试剂盒(CaspACETM Assay System，Colorimetric，Promega) 说明书操作。酶标仪测 405 nm 处吸光度（A）值，计算 caspase3 活性。 1.4.4 MPO 测定 在生理盐水冰盘上迅速取部分左肾组织，按质量体积比加入 9 倍的预冷生理盐水，制成 10%组织匀浆，普通离心机（3 500 r/min）离心 15 min，取上清液置于-70 冰箱。待标本收集齐后，按 MPO 试剂盒说明测定 MPO 活性。 1.4.5 肾组织中 ICAM1 检测 应用免疫组化方法，操作按ICAM1 试剂盒说明书进行。镜下观察，胞浆 ICAM1 阳性染色为棕黄色，采用医学图像分析软件(PIXERA，美国)进行分析。每例切片随机取 10 个肾小球视野，光学显微镜采集图像。输入图像分析系统内进行吸光度（A）测量，同时计算阳性着色面积，计算阳性指数，取平均值。阳性指数=阳性信号面积阳性强度(平均灰度值)/肾小球面积。 61.5 统计学处理 各组实验数据用s 表示。采用 SPSS 13.0 软件进行统计学分析，其中多个样本均数间比较采用完全随机设计的单因素方差分析，两两比较采用 LSD 检验。 2 结果 2.1 caspase3 抑制剂对 I/R 损伤肾脏功能的影响 肾脏功能指标 Cr、BUN 值 3 组间差异均有显著性（F=574.13、303.95,P0.01） ；缺血再灌注组较假手术组均明显升高（P0.01） ，说明小鼠肾脏 I/R 模型制备成功；治疗组与缺血再灌注组比较，Cr、BUN 值均明显降低，差异有显著性（P0.01） 。见表 1。 表 1 各组小鼠相关检测指标比较（略） 各检测指标多组间比较，F=36.10 574.13,P0.01；与假手术组相比，*P0.05，*P0.01; 与缺血再灌注组相比，P0.05,P0.01 2.2 caspase3 抑制剂对 I/R 损伤肾脏细胞凋亡的影响 假手术组肾脏组织只有极少数细胞发生凋亡，而缺血再灌注7组细胞凋亡明显增多，治疗组与缺血再灌注组比较，细胞凋亡数减少，但仍多于假手术组。肾细胞 AI 各组间相比较，差异有显著意义（F=312.29,P0.01） ，其中缺血再灌注组较假手术组明显升高（P0.01） ；治疗组与缺血再灌注组比较，凋亡指数明显降低(P0.01)。见表 1。 2.3 AcDEVDCHO 对 I/R 损伤肾脏组织 caspase3 活性的影响 肾组织 caspase3 活性 3 组间差异具有显著性（F=146.20,P0.01） ；缺血再灌注组较假手术组明显增强（P0.01） ；治疗组与缺血再灌注组比较，caspase3 活性明显降低（P0.05） 。见表 1。 2.4 caspase3 抑制剂对 I/R 损伤肾脏炎症反应的影响 假手术组肾组织 ICAM1 蛋白阳性表达甚微，而在缺血再灌注组的肾小球、肾小管、肾小血管均有不程度的 ICAM1 蛋白阳性表达，且以肾小球表达为主，治疗组与缺血再灌注组比较，ICAM1 蛋白阳性表达减少。炎症相关指标 MPO 活性、ICAM1阳性指数 3 组间差异均有显著性（ F=66.21、36.10,P0.01） ；缺血再灌注组与假手术组比较，炎症相关指标均明显升高（P0.05） ；治疗组与缺血再灌注组比较，炎症相关指标均明显8降低（P0.05） 。见表 1。 3 讨论 肾 I/R 损伤的病理生理机制非常复杂，是多途径、多因素共同参与的过程，包括氧自由基的作用、钙超载、脂质过氧化损伤、炎症反应、细胞凋亡等，其中细胞凋亡的作用越来越受到人们的重视6,7。目前认为 caspase 依赖的细胞凋亡途径在肾脏 I/R 损伤诱导的肾小