金黄色葡萄球菌检验金黄色葡萄球菌检验 1 1 概况概况 葡萄球菌属微球菌科 本菌有葡萄球菌属微球菌科 本菌有1919个菌种 个菌种 从人体上可检出从人体上可检出1212个种 个种 葡萄球菌属主要与皮肤腺体和温血动物的葡萄球菌属主要与皮肤腺体和温血动物的 粘膜相关系 有些种是人及动物的条件致粘膜相关系 有些种是人及动物的条件致 病菌 病菌 金黄色葡萄球菌对人类有致病性 通常被金黄色葡萄球菌对人类有致病性 通常被 称为病原性球菌 金黄色葡萄球菌可引起称为病原性球菌 金黄色葡萄球菌可引起 化脓性炎症 又称为化脓性球菌 化脓性炎症 又称为化脓性球菌 2 2 金黄色葡萄球菌的生物学特性金黄色葡萄球菌的生物学特性 形态与染色 形态与染色 金黄色葡萄球菌的典型形态呈球形 直径金黄色葡萄球菌的典型形态呈球形 直径0 40 4 1 2 m1 2 m 大小不一 平均直径约为 大小不一 平均直径约为0 8 m0 8 m 革兰氏染色阳性 呈葡萄串状排列 无鞭毛 无革兰氏染色阳性 呈葡萄串状排列 无鞭毛 无 芽胞 在陈旧培养物中 衰老的菌体常转为革兰芽胞 在陈旧培养物中 衰老的菌体常转为革兰 氏阴性 氏阴性 3 3 培养特性 培养特性 易培养 对营养要求不高 在普通培养基中生长良易培养 对营养要求不高 在普通培养基中生长良 好 好 需氧或兼性厌氧 需氧或兼性厌氧 最适生长温度最适生长温度37 37 最适生长 最适生长pH 7 4pH 7 4 耐盐性强 耐盐性强 在含在含1010 15 15 的氯化钠培养基中仍能生长 可用于的氯化钠培养基中仍能生长 可用于 筛选菌种 筛选菌种 在普通营养琼脂平板上培养在普通营养琼脂平板上培养1818 2424 可形成圆形 可形成圆形 表面光滑 不透明的菌落 可产生金黄色色素 表面光滑 不透明的菌落 可产生金黄色色素 色素为脂溶性 不溶于水 故色素只局限于菌落内色素为脂溶性 不溶于水 故色素只局限于菌落内 不渗至培养中 不渗至培养中 4 4 在血平板上可形成明显透明的溶血环 为在血平板上可形成明显透明的溶血环 为 型溶血型溶血 可产生卵磷脂 在卵黄高盐培养基上形成周围有可产生卵磷脂 在卵黄高盐培养基上形成周围有 白色沉淀环的菌落 白色沉淀环的菌落 大多数菌株分解葡萄糖 麦芽糖 蔗糖 产酸不大多数菌株分解葡萄糖 麦芽糖 蔗糖 产酸不 产气 甲基红试验 产气 甲基红试验 VPVP试验多为阳性 不产生靛试验多为阳性 不产生靛 基质 触酶阳性 基质 触酶阳性 5 5 金黄色葡萄球菌的酶金黄色葡萄球菌的酶 金黄色葡萄球菌可产生血浆凝固酶和耐热金黄色葡萄球菌可产生血浆凝固酶和耐热DNADNA酶酶 这两种酶均与金黄色葡萄球菌的致病性有关 这两种酶均与金黄色葡萄球菌的致病性有关 血浆凝固酶 与金黄色葡萄球菌的致病力密切相关血浆凝固酶 与金黄色葡萄球菌的致病力密切相关 一般认为 血浆凝固阳性的金黄色葡萄球菌菌株 一般认为 血浆凝固阳性的金黄色葡萄球菌菌株 有致病力 否则为无力的菌株 血浆凝固酶对热稳有致病力 否则为无力的菌株 血浆凝固酶对热稳 定 能抵抗定 能抵抗60 30min60 30min甚至甚至100 30min100 30min后 仍能后 仍能 保存大部分活性 保存大部分活性 耐热耐热DNADNA酶作为除血浆凝固酶外鉴定金黄色葡萄酶作为除血浆凝固酶外鉴定金黄色葡萄 球菌致病力的指标之一 该酶的最适球菌致病力的指标之一 该酶的最适pHpH为为9 09 0 6 6 金黄色葡萄球菌肠毒素 是金黄色葡萄球菌一种重金黄色葡萄球菌肠毒素 是金黄色葡萄球菌一种重 要的致病物质 本菌引起的食物中毒是因为食品污要的致病物质 本菌引起的食物中毒是因为食品污 染了金黄葡萄球菌后 由细菌产生大量肠毒素而导染了金黄葡萄球菌后 由细菌产生大量肠毒素而导 致的 致的 近年报导表明 近年报导表明 50 50 以上的金黄色葡萄球菌菌株在以上的金黄色葡萄球菌菌株在 实验室条件下可产生肠毒素 并且实验室条件下可产生肠毒素 并且1 1个菌株能产生个菌株能产生 两种或两种以上的肠毒素 两种或两种以上的肠毒素 肠毒素是一种可溶性蛋白质 由单个无分枝的肽链肠毒素是一种可溶性蛋白质 由单个无分枝的肽链 组成 分子量约为组成 分子量约为30003000左右 易溶于水 难溶于左右 易溶于水 难溶于 有机溶剂 有机溶剂 金黄色葡萄球菌的肠毒素金黄色葡萄球菌的肠毒素 7 7 耐热 经耐热 经100 100 煮沸煮沸30min30min不被破坏 也不受胰蛋不被破坏 也不受胰蛋 白酶的影响 食物中的肠毒素耐热性更强 一般白酶的影响 食物中的肠毒素耐热性更强 一般 烹调温度不能将其破坏 烹调温度不能将其破坏 218 248 218 248 的油中需的油中需 30min30min才能被破坏 可引起急性胃肠炎 才能被破坏 可引起急性胃肠炎 根据肠毒素的血清型 可分根据肠毒素的血清型 可分A A B B C C C C 1 1 C C 2 2 DD E 5 E 5 个型 个型 A A型肠毒素引起的食物中毒较多型肠毒素引起的食物中毒较多 约占 约占50 50 左右 其他依次为左右 其他依次为DD C C B B和和E E型 也型 也 有有A A DD A A B B A A C C B B C C等 等 8 8 A A型肠毒素毒力较强 摄入型肠毒素毒力较强 摄入1 g1 g即可引起中毒 即可引起中毒 B B 型毒力较弱摄入型毒力较弱摄入25 g25 g 才引起中毒 一般认为引 才引起中毒 一般认为引 起人中毒的最小剂量是起人中毒的最小剂量是1 0 7 2 g kg1 0 7 2 g kg 9 9 金黄色葡萄球菌的检测程序金黄色葡萄球菌的检测程序 检样检样25g mL 25g mL 225mL225mL生理盐水或磷酸盐缓冲液生理盐水或磷酸盐缓冲液 7 5 7 5 氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或10 10 氯化钠胰酪胨大豆肉汤氯化钠胰酪胨大豆肉汤 36 1 36 1 Baird ParkerBaird Parker平板 血平板平板 血平板 涂片染色涂片染色观察溶血观察溶血 血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验 报告报告 血平板血平板18 24h18 24h Baird ParkerBaird Parker平板平板 18 24h18 24h或或45 48h45 48h BHIBHI肉汤和营养琼脂小斜面肉汤和营养琼脂小斜面 36 1 36 1 18 24h18 24h 1010 增菌培养基增菌培养基 7 5 7 5 氯化钠肉汤 为葡萄球菌选择性增菌培养基氯化钠肉汤 为葡萄球菌选择性增菌培养基 因金黄色葡萄球有耐受高盐的特性 因而能在 因金黄色葡萄球有耐受高盐的特性 因而能在 此增菌液中生长 除某些嗜高盐的海洋菌外 大此增菌液中生长 除某些嗜高盐的海洋菌外 大 多数细菌都被增菌液中的高盐所抑制 多数细菌都被增菌液中的高盐所抑制 胰酪胨大豆肉汤 含氯化钠达胰酪胨大豆肉汤 含氯化钠达10 10 以胰酪胨替 以胰酪胨替 代牛肉浸粉 并加入少量磷酸氢二钾和葡萄糖促代牛肉浸粉 并加入少量磷酸氢二钾和葡萄糖促 进葡萄球菌的生长 进葡萄球菌的生长 1111 样品的稀释样品的稀释 固体和半固体样品 称取固体和半固体样品 称取25g25g样品至盛有样品至盛有225 mL225 mL磷磷 酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌均质杯内 酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌均质杯内 8000r min8000r min 10000 r min10000 r min均质均质1min1min 2min2min 或 或 放入盛有放入盛有225 mL225 mL稀释液的无菌均质袋中 用拍击式稀释液的无菌均质袋中 用拍击式 均质器拍打均质器拍打1min1min 2min2min 制成 制成1 101 10的样品匀液 的样品匀液 液体样品 以无菌吸管吸取液体样品 以无菌吸管吸取25mL25mL样品至盛有样品至盛有 225mL225mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶 瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠 中 充分混匀 中 充分混匀 制成制成1 101 10的样品匀液 的样品匀液 1212 1313 增菌与分离培养增菌与分离培养 增菌培养 吸取增菌培养 吸取5mL5mL上述样品匀液 接种于上述样品匀液 接种于50mL 50mL 7 5 7 5 氯化钠肉汤或氯化钠肉汤或10 10 胰酪胨大豆肉汤培养基内 胰酪胨大豆肉汤培养基内 36 1 36 1 培养培养18h18h 24h24h 金黄色葡萄球菌在 金黄色葡萄球菌在7 5 7 5 氯化钠肉汤中呈混浊生长 污染严重时在氯化钠肉汤中呈混浊生长 污染严重时在10 10 胰酪胰酪 胨大豆肉汤内呈混浊生长 胨大豆肉汤内呈混浊生长 将上述培养物 分别划线接种到将上述培养物 分别划线接种到Baird ParkerBaird Parker平板平板 和血平板 血平板和血平板 血平板36 1 36 1 培养培养18h18h 24h24h Baird ParkerBaird Parker平板平板36 1 36 1 培养培养18h18h 24h24h或或45h45h 48h48h 1414 分离培养基分离培养基 Baird ParkerBaird Parker琼脂 培养基中含有琼脂 培养基中含有卵黄亚碲酸钾卵黄亚碲酸钾 能抑制大 能抑制大 多数细菌的繁殖 并能促进金黄色葡萄球菌的生长使其产生多数细菌的繁殖 并能促进金黄色葡萄球菌的生长使其产生 黑色和晕圈 培养基中的丙酮酸钠和甘氨酸也能促进金黄色黑色和晕圈 培养基中的丙酮酸钠和甘氨酸也能促进金黄色 葡萄球菌的生长 葡萄球菌的生长 金黄色葡萄球菌的菌落形态 圆形 光滑凸起 湿润 直径金黄色葡萄球菌的菌落形态 圆形 光滑凸起 湿润 直径 约约2 3mm2 3mm 颜色呈灰色到黑色 边缘为淡色 周围为一混 颜色呈灰色到黑色 边缘为淡色 周围为一混 浊带 在其外层有一透明圈 用接种针接触菌落似有奶油树浊带 在其外层有一透明圈 用接种针接触菌落似有奶油树 胶的硬度 偶而可见无混浊带和透明圈的非典型菌落 胶的硬度 偶而可见无混浊带和透明圈的非典型菌落 长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产 生的黑色较淡些 外观可能粗糙并干燥 生的黑色较淡些 外观可能粗糙并干燥 1515 1616 分离培养基分离培养基 血琼脂 是一种基础培养基 含有血琼脂 是一种基础培养基 含有5 5 的的 脱纤维血脱纤维血 羊血或兔血羊血或兔血 用于观察金黄色 用于观察金黄色 葡萄球菌的溶血现象 金黄色葡萄球菌在葡萄球菌的溶血现象 金黄色葡萄球菌在 血琼脂平板上呈血琼脂平板上呈 溶血 溶血 金黄色葡萄球菌的菌落形态 呈金黄色 金黄色葡萄球菌的菌落形态 呈金黄色 有时也呈白色 大而突起 圆形 不透明有时也呈白色 大而突起 圆形 不透明 表面光滑 周围有透明的 表面光滑 周围有透明的 溶血环 溶血环 1717 1818 革兰氏染色革兰氏染色 1919 血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验 试验原理 致病性的金黄色葡萄球菌产生的血试验原理 致病性的金黄色葡萄球菌产生的血 浆凝固酶 使血浆中纤维蛋白原转变为纤蛋白浆凝固酶 使血浆中纤维蛋白原转变为纤蛋白 附着于细菌表面 附着于细菌表面 产生凝固 产生凝固 金黄色葡萄球菌可产生两种凝固酶 一种是与金黄色葡萄球菌可产生两种凝固酶 一种是与 细胞壁结合的凝固酶 为结合凝固酶 另一种细胞壁结合的凝固酶 为结合凝固酶 另一种 是菌细胞释放于培养基中 为游离凝固酶 二是菌细胞释放于培养基中 为游离凝固酶 二 者的抗原性不同 者的抗原性不同 2020 血浆凝固酶试验血浆凝固酶试验 挑取挑取BairdBaird ParkerParker平板或血平板上可疑菌落平板或血平板上可疑菌落1 1个或个或 以上 分别接种到以上 分别接种到5mL BHI5mL BHI和营养琼脂小斜面 和营养