实验前预备工作 请各位同学按照学号顺序就做 每排坐四 位同学 为一个小组 请各小组同学将各自桌面上的所有玻璃仪 器清洗干净 放入烘箱烘干备用 1 双水相萃取 淀粉酶及其影响因素分析 生物分离工程 综合平台实验 2 实验背景介绍 3 双水相萃取 概念 利用溶质在两个互不相溶的亲水相之间的 分配系数不同而进行分离的萃取技术 问题 双水相成相机理及条件 影响蛋白质在双水相中分配的因素 双水相的优势 4 1 双水相的类型与形成原因 双水相类型 类类型常用 高聚合物 高聚物 非离子型高聚物 非离子型高聚物 PEG Dex 聚丙烯烯二醇 Dex 离子型高聚物 非离子型高聚物羧羧甲基纤维纤维 素钠钠 Dex 离子型高聚物 离子型高聚物 羧羧甲基纤维纤维 素钠钠 羧羧甲 基葡聚糖钠钠 高聚物 盐盐非离子型高聚物 无机盐盐PEG 磷酸盐盐 硫酸盐盐 PEG 聚乙二醇 Dex 葡聚糖 5 1 双水相的类型与形成原因 双水相形成原因 聚合物 聚合物 聚合物的不相溶性 当两种高 分子聚合物之间存在斥力作用时 由于相对分子质量较大 分子 之间的相互排斥作用于混合过程 中熵的增加相比占主导地位 一 种聚合物分子的周围将聚集同种 分子而排斥其他分子 当达到平 衡时 形成分别富含不同聚合物 的两相 聚合物 盐 盐析作用 2 2 葡聚糖水溶液与等 体积的0 72 甲基纤维素 钠水溶液混合静置 6 常用的双水相 PEG DEX 平衡后 上相富含PEG 下相富含Dex PEG 无机盐 平衡后 上相富含PEG 下相富含无机盐 7 相图的组成及意义 双节线 曲线TKB 上方为双水 相 下方为均一相 系线 直线TMB 系线上各点处系统总浓度不同 但均分 成组成相同 T B 而体积不同的两相 两相体积近似服从杠杆原则 即 VT VB BM MT K点 系线的长度是衡量两相之间差 别的尺度 系线越长 两相间差别 越大 反之则越小 在K点系线长度 趋向为零 两相差别消失 任何溶 质在两相间的分配系数均为1 此点 称为临界点 双水相 均一相 8 影响双水相分配理论 2 1 成相聚合物的相对分子质量 2 2 成相聚合物的浓度 2 3 盐的种类和浓度 2 4 pH的影响 2 5 温度的影响 9 双水相的优势 含水量高 萃取条件温和 不会引起生物 活性物质变性 没有有机溶剂残留 去细胞碎片的同时纯化蛋白 使分离过程 更加经济 容易实现反萃取 10 11 实验安排 星期六上午 8 00 11 40 实验分组 试剂配 置 实验一 星期六下午 2 00 5 30 实验二与实验三 星期日上午 8 00 11 30 实验四与实验五 星期日下午 2 00 5 30 实验二三四五的结 果分析与讨论 完成实验报告 整理教室卫生 12 实验一 PEG NH4 2SO4双水相 相图的制作 13 一 实验目的 掌握浊点法制作双水相相图 双节线 的方法 分析比较PEG分子量对双水相成相的影响 14 二 实验原理 因层析作用 一定浓度的 PEG与 NH4 2SO4混合溶液可 形成双水相 相图即用于描述双 水相的成相条件及定量关系 双节线是双水相与均一相的 分界线 可用浊点法测定制作双 水相图中的双节线 双水相 均一相 15 二 实验材料 1 PEG 400 800 2000 见公共实验台 2 43 的 NH4 SO4溶液 称取43g硫酸铵 见公 共实验台 溶解于适量水中 定容至100mL 称重 计算密度 3 蒸馏水 值日生从117打水 放在桶中备用 4 碱式滴定管 5 试管 干燥无水 16 三 实验步骤 PEG 800与2000为固体 可于60 加热熔化后称取 17 三 实验步骤 次数 H2O加量 g NH4 2SO4溶液 加量 纯 NH4 2SO4 累计量 g 溶液累 计 总量 g PEG NH4 2SO4 mL g 10 5 20 3 0 5 30 3 0 5 40 3 0 5 50 3 0 5 60 5 红笔标记的体积可机动 18 四 实验注意事项 使用干燥洁净的试管 称取PEG时 要滴加在试管底部 避免 挂到试管壁上 滴定和加水过程 避免液体溅到试管壁 上 初始几次滴定过程 必须要缓慢逐滴滴 加 NH4 2SO4溶液 若滴下 NH4 2SO4后 溶液出现浑浊 但振荡后又恢复澄清 说明已接近浊点 之后要缓慢逐滴滴加 NH4 2SO4溶液 19 五 实验结果与分析 次数 H2O加量 g NH4 2SO4溶液 加量 纯 NH4 2SO4 累计量 g 溶液累 计 总量 g PEG NH4 2SO4 mL g 10 5 20 3 30 3 40 3 50 5 60 5 NH4 2SO4溶液累计加量V盐 ml 滴定后读数 初始读 数 NH4 2SO4溶液累计加量m盐 g V盐 纯 NH4 2SO4累计量m g 43 V盐 溶液累计总量m总 g mPEG m盐 m水 PEG400 mPEG m总 NH4 2SO4 m m总 20 五 实验结果与分析 不同分子量PEG的相图 如左图所示 由图可知 随PEG分子量的增大 双 节线对称性 临 界点 原点 表 明其系统分相动力 21 六 思考题 为什么随PEG分子量增大 双水相系统分相动力 增强 22 实验分组安排 每四个人一大组 每两个人一小组 分别完成两 种PEG的相图制作 交叉验证 实验完成后 及时清洗玻璃仪器 置于烘箱烘干 备用 完成下午试剂的配置工作 23 实验二 三 PEG分子量 PEG浓度 对 淀粉酶在双水相中分配的影响 24 一 实验目的 掌握PEG浓度 分子量对 淀粉酶分配行为影响 的研究方法 分析比较PEG分子量 PEG浓度对 淀粉酶分配 行为的影响 25 二 实验原理 PEG的分子量对 淀粉酶的分配具有重要影响 随 PEG分子量的增大 双水相分相动力增强 两相间差异 增大 选择性增强 但PEG的疏水性增强 不利于蛋白 向上相的分配 26 二 实验原理 在PEG分子量一定的条件下 PEG浓度以及硫 酸铵的浓度的改变均会改变改变两相间的性质差 异 从而影响 淀粉酶在两相间的分配 27 三 实验材料 PEG分子量的影响 1 0 02 mol L PB 7 0 的配置 取 6 1ml 0 2M的Na2HPO4溶液加3 9 mL0 2M 的NaH2PO4混匀 用时稀释至2000 mL 全班一起配置 每组分取400mL 于三角烧瓶 2 1 的 淀粉酶酶液 称取2g 淀粉酶溶解于200mL 0 02 mol L pH 7 0的 磷酸缓冲液中 全班一起配置 过滤后于4摄氏度备用 3 PEG 800 称取65 g PEG800 于60摄氏度水浴加热熔化备用 4 PEG 2000 称取25 g PEG 2000 于60摄氏度水浴加热熔化备用 全班一 起配置 5 40 的硫酸铵溶液 称取80 g硫酸铵 加适量pB 7 0 溶解 定重至200g 6 带刻度的玻璃离心管4 根 小组 塑料离心管4根 小组 16 根干燥的玻璃试管 28 四 实验步骤 PEG分子量的影响 PEG 400 为液体 直接添加1 6g 条件 PEG 16 硫酸铵 20 pH7 0 加完原料与蛋白后必须将离心试管沿轴向充分振摇 使固体充分溶解 29 四 实验步骤 PEG 分子量 上相 体积 mL 上相 OD280 260 下相 体积 mL 下相 OD280 260 400 800 2000 1 上下相体积的读取 根据刻度读数直接读取 2 上下相蛋白含量的测定 上相稀释两倍 下相不稀释 测定OD280与 OD260 通过公式1 45 OD280 0 74 OD260 30 二 实验材料 PEG浓度 1 PEG 800溶液 同前 2 0 02 mol L PB 7 0的配置 同前 3 1 的 淀粉酶酶液 同前 4 40 的硫酸铵溶液 同前 5 带刻度的玻璃离心管4 根 小组 塑料离心管4根 小组 16 根干燥的玻璃试管 31 三 实验步骤 PEG浓度的影响 总重量为10g 硫酸铵浓度固定为20 PEG分子量选择800 称取的PEG800 对应的PEG浓度分别为多少 32 四 实验步骤 PEG 浓度 上相 体积 mL 上相 OD280 260 下相 体积 mL 下相 OD280 260 1 上下相体积的读取 根据刻度读数直接读取 2 上下相蛋白含量的测定 上相稀释两倍 下相不稀释 测定OD280与 OD260 通过公式1 45 OD280 0 74 OD260 33 五 实验注意事项 实验中各组添加量总重量为10g 加完原料与蛋白后必须将离心试管沿轴向充分振摇 使固 体充分溶解 上下相分离时注意吸管小心吸出上相 将多余上相和少量 下相弃去 换吸管 吸出下相 每个样品组均需设置空白对照 用于调零 34 六 实验数据处理分析 分子量 D 相比 上相酶 浓度 下相酶 浓度 分配系数 400 800 2000 R VT VB VT为上相体积 VB为下相体积 K CT CB CT为上相浓度 CB为下相浓度 35 六 实验数据处理分析 1 分析分配系数是大于1还是小于1 以确定蛋白 的分配选择性 2 分析分配系数随PEG分子量的增大 其趋势是趋 向等于1还是趋向远离1 显示两相性质差异以 及蛋白分配差异 3 分析回收率 确定蛋白质在选择性分配某相时 在该相的回收效率 36 六 实验数据处理分析 案例 37 六 实验数据处理分析 案例 38 实验三 五 硫酸铵浓度 pH值 对 淀粉酶在双水相中分配的影响 39 一 实验目的 硫酸铵浓度 pH值对 淀粉酶分配行为影响的研 究方法 分析比较硫酸铵浓度 pH值对 淀粉酶分配行为 的影响 40 二 实验原理 在PEG分子量一定的条件下 PEG浓度以及硫 酸铵的浓度的改变均会改变改变两相间的性质差 异 从而影响 淀粉酶在两相间的分配 pH值会影响蛋白质及溶液的解离状态 从而 影响蛋白质在两相中的分配 41 二 实验材料 硫酸铵浓度 1 PEG 800溶液 同前 2 0 02 mol L PB 7 0的配置 同前 3 1 的 淀粉酶酶液 同前 4 40 的硫酸铵溶液 同前 5 带刻度的玻璃离心管4 根 小组 塑料离心管4根 小组 16 根干燥的玻璃试管 42 三 实验步骤 硫酸铵浓度的影响 对应的硫酸铵浓度分别为多少 固定条件 PEG 800 PEG浓度20 pH值7 0 43 三 实验步骤 硫酸铵 浓度 上相 体积 mL 上相 OD280 260 下相 体积 mL 下相 OD280 260 1 上下相体积的读取 根据刻度读数直接读取 2 上下相蛋白含量的测定 上相稀释两倍 下相不稀释 测定OD280与 OD260 通过公式1 45 OD280 0 74 OD260 44 二 实验材料 pH值 1 0 02 mol L pH6 4的磷酸缓冲液的配置 取2 65 mL 0 2M的Na2HPO4溶液加7 35 mL0 2M的NaH2PO4混 匀 稀释至100mL 每组分25mL 2 0 02 mol L pH5 8 的磷酸缓冲液的配置 取0 8ml 0 2M的Na2HPO4溶液加9 2mL0 2M的NaH2PO4混匀 稀释至100mL 3 0 02 mol L pH8 0的磷酸缓冲液的配置 取 9 47 ml 0 2M的Na2HPO4溶液加 0 53 mL0 2M的NaH2PO4混 匀 稀释至100mL 每组分25mL 45 三 实验步骤 pH值的影响 固定条件 PEG 800 PEG浓度16 硫酸铵浓度20 46 四 实验数据处理 PH值 相比 上相酶 浓度 下相酶 浓度 分配系数 5 8 6 4 7 0 8 0 R VT VB VT为上相体积 VB为下相体积 K CT CB CT为上相浓度 CB为下相浓度 47 四 实验注意事项 实验中各组添加量总重量为10g 加完原料与蛋白后必须将离心试管沿轴向充分振摇 使固 体充分溶解 上下相分离时注意吸管小心吸出上相 将多余上相和少量 下相弃去 换吸管 吸出下相 每个样品组均需设置空白对照 用于调零 48 六 实验数据处理分析 1