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1无泵驱动体外膜肺治疗急性呼吸衰竭犬肺组织内皮素 1 前体原 mRNA 的表达【摘要】 目的: 观察双侧股动脉 股静脉无泵驱动体外膜肺(bAVECMO )治疗急性呼吸衰竭犬肺组织内皮素1 前体原和内皮素1 (ET1 )的表达. 方法: 10 只犬在建立急性呼吸衰竭模型情况下给予 bAVECMO 治疗. 分别于模型建立完成时、转流开始后1,2 ,3 , 4 h 取肺组织 . 应用放免及 RTPCR 技术,观测bAVECMO 期间肺组织匀浆 ET1 变化、肺组织 ppET1 mRNA的转录表达变化. 结果:犬 ARDS 模型肺组织匀浆 ET1 含量转流2 h 达到高值,之后缓慢下降. 方差分析表明肺组织匀浆 ET1 的均数在转流前后差异有统计学意义. 肺组织匀浆 ET1 转流 3 h 与 4 h差异无统计学意义. RTPCR 对 ppET1 mRNA 的结果与肺组织匀浆 ET1 放免结果相一致. 结论:对于急性呼吸衰竭 bAVECMO的早期治疗有积极意义. 【关键词】 急性呼吸衰竭 内皮素 1 动脉 静脉无泵驱动体外膜肺氧合 0 引言 近年来研究发现急性呼吸衰竭(ARF)和急性呼吸窘迫综合症(ARDS)时内皮素1 mRNA 表达显著增强,说明 ET1 参与了急性肺损伤的病理生理过程. 在对 ARF、ARDS 的治疗中无泵驱动体外膜肺辅助(AV) 转流技术(AVECMO) 由于其有效并对血液有形成份2破坏轻等优点,已被应用于临床1. 在应用 AVECMO 转流中,国外均采用单侧股动脉 股静脉 ECMO 转流,在临床中表现了一定的不足,如引流量不够大,影响了 AVECMO 的效果;但如应用大口径动脉插管来增加动脉引流,则会严重影响插管侧下肢血液供应等. 本项研究首次采用双侧股动脉 股静脉无泵驱动体外膜肺(bAVECMO )转流技术,通过治疗犬急性呼吸衰竭模型,观察肺组织 ppET1 mRNA,ET1 的变化,为临床提供参考依据. 1 材料和方法 1.1 材料 选择健康成年家犬 10 只,雌雄不限,体质量1835(23.44.7) kg,用 35 g/L 苯巴比妥 100 mg/kg 腹腔注射麻醉,待犬意识不清时,气管插管与麻醉机连接. 常规消毒铺巾,分别解剖犬左、右两侧的股动脉及股静脉,全身肝素化,用量为 1 mg/kg,股动脉,股静脉上、下两端分别套丝线,结扎下端的股动脉、股静脉. 阻断股动脉、股静脉上端,再阻断与结扎血管的中下端,切开血管. 根据动、静脉内径的大小选择不同型号的 PVC 动、静脉插管,插管后结扎固定以防止脱出,常规缝合皮下、皮肤,防止伤口渗血. 将动、静脉插管与 bAVECMO 装置连接. 右侧胸部开胸沿着第 4 肋间进胸,切开心包分别将心包固定在切口边缘,主动脉根部置入测压针管及测压装置,将此装置与飞利浦有创血压、心率动态监护仪连接. 当 bAVECMO 转流时,通过 bAVECMO端口应用 1000 mL/L 氧气,其用量为(1.20.4) L/min. 建立循环后,3根据不同的转流时间收集标本. 在体外循环开始前,经胸部切口取右肺下叶少许组织(10 mm10 mm) ,置液氮罐待检测. 制作呼吸衰竭动物模型进行试验. 应用潘克罗宁(Pancuronrum,0.10.2 mg/kg) ,首次剂量为 4 mg,以后每30 min 左右追加 2 mg 使呼吸完全消失. 通过麻醉机调节呼吸频率和潮气量(犬在安静状态下潮气量如体质量在 16.430.5 kg,潮气量多在 251432 mL). 采用血气分析仪测定犬动脉血 pH 值、动脉血氧分压、动脉血氧饱和度及动脉血二氧化碳分压值,当达到呼吸衰竭指标时,经右心房抽血 10 mL 于注射器内,立即密封置冰盒待检. 另经胸部切口取右肺下叶少许组织(10 mm10 mm) ,置冰盒后待检测. 开始 bAVECMO 转流实验后 1, 2, 3, 4 h,分别经右心房抽血 10 mL、胸部切口取右肺下叶少许组织(10 mm10 mm) ,置液氮罐待检测. 1.2 方法 1.2.1 肺组织匀浆 ET1 含量测定 采用 SN 695 型全自动 计数器( 上海原子核所,放射免疫药盒购自解放军总医院科技开发中心放免所),以放射免疫法测定标本ET1 含量. 1.2.2 肺组织 ppET1 检测 采用 RTPCR 法,步骤如下:采用 Trizol 一步法提取研磨肺组织总 RNA 并测定其浓度和纯度 . 从 GenBank 下载内皮素1 前体原(preproET1) 的基因序列( NM001002 956),使用 PPrimer 45.0 软件分析设计引物( TaKaRa 公司合成). preproET1 的一对引物为:sense: 5ATGGACCACTTGGAAAGCAG3; antisense: 5GGCACCTGAGTGAGACACAA3,PCR 产物长度 135 bp. 以 actin 为内参照: sense: 5CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC3; antisense: 5AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC3,PCR 产物长度:587 bp. RTPCR 条件:采用 TaKaRa 公司 One Step RNA PCR Kit(AMV)试剂盒. 每个反应加总 RNA 0.75 g,上、下游引物各20 pmol,逆转录酶、Taq 酶、RNasin、dNTP 及 Buffer 均按照试剂说明加样. 50逆转录 30 min,94变性 2 min,继以 PCR 扩增. 扩增条件如下:变性 94 ,30 ;退火 55,30 ;延伸 72,1.5 min. 共 35 个循环 . RTPCR 产物以 20 /琼脂糖电泳,以目的基因 cDNA 与 actincDNA 量的比值表示目的基因 mRNA表达的相对强度. 统计学处理: 数据以 xs 表示,用 SPSS 10.0 统计软件进行重复测量资料的方差分析. P0.05 有统计学意义 . 2 结果 2.1 内皮素 PPET1 mRNA 表达犬急性呼吸衰竭模型肺组织内皮素 PPET1 mRNA 表达在应用 bAVECMO 早期治疗时有显著变化. 其 PPET1 mRNA 表达在模型建立完时上升经转流治疗 2 h 后无进一步上升,且有下降趋势,与肺组织匀浆放免结果(表1)相一致. 52.2 肺组织内皮素变化肺组织匀浆 ET1 含量转流 2 h 达到高值,之后缓慢下降. 肺组织匀浆 ET1 的均数变化在转流过程中有统计学意义, 但转流 3 h 与 4 h 间无统计学差别 (表 1).表 1 肺组织匀浆ET1 和 ppET1 mRNA 表达在转流期间变化(略) 3 讨论 在对 ARF,ARDS 治疗技术探索中, ECMO 是一项具有重要意义的治疗方法. 但传统的 ECMO 治疗有血细胞损伤致出血及栓塞等诸多缺点,这些都是由于 ECMO 治疗时血泵的使用引起的. bAVECMO 避免了传统 ECMO 治疗方法的诸多缺点 ,对呼吸衰竭动物模型肺组织内皮素1 前体原的研究对其应用推广具有意义. 内皮素(ET)是机体在缺氧、应激状态下产生的一种致损伤因子. 人体存在 4 种内皮素( ET1,ET2 ,ET3 ,VIC) ,研究认为2ET1 是缺氧致肺血管收缩的支撑因素,而肺是 ET1 的主要生物合成和代谢场所. 影响 ET1 释放的因素均是直接、间接的通过影响 ppET1 mRNA 在肺部的转录和翻译而引起 ET1 的释放. 在我们建立了呼吸衰竭模型条件下,缺氧快速而敏感地促进包括缺氧诱导因子1(HIF1) 在内的细胞因子对缺氧反应基因加以调控, 通过与肺血管内皮细胞中作为目标基因的 ET1 基因结合位点结合,激活 ET1 基因,经剪切后合成为内皮素前体原1 mRNA(ppET1 mRNA) ,其在胞浆中粗面内质网内翻译合成为内皮素前体原1 (ppET1 ) ,而再水解分裂为内皮素1 前体(pET1),pET1 的生物活性只有转换成 ET1 才发挥其生理效应,6而 ET1 降解的时相却极短(仅 12 min 就有 60%以上的 ET1 被清除, 且不伴有相应降解产物的出现). 由于其降解过程短暂,需要ppET1 mRNA 表达的增加维持肺组织中 ET1 的含量较长时间的升高. 这表明肺组织中 ET1 的含量升高是由于缺氧致 ET1 基因启动,使 ppET1 mRNA 的翻录、合成增加所致,且其含量的维持需缺氧诱导 ppET1 mRNA 的表达持续. 在 bAVECMO 的早期转流逐步改善了缺氧及二氧化碳储留后,肺组织中促使 ppET1 mRNA表达的因素减少,ppET1 mRNA 表达呈下降趋势,肺组织匀浆中ET1 测定水平降低与生成减少相关联,这与我们 RTPCR 对ppET1 mRNA 的定量分析相一致也与放免试验对肺组织匀浆ET1 含量测定结果相一致,但与部分研究中 ET1 水平在经治疗后短期仍升高较晚才出现下降不一致3-4 ,对此我们认为在本研究中 ppET1 mRNA 在肺脏中的表达早期即有下降趋势而使肺组织ET1 水平下降可能与 bAVECMO 的早期应用相关,在细胞未产生不可逆损伤前,单纯消除缺氧诱导因素后 ppET1 mRNA 表达即减少,同时使 ET1 释放相应减少. 因此,我们认为对于急性呼吸衰竭而言,bAVECMO 早期应用以便对缺氧诱导 ppET1 mRNA 表达因素早期消除,对患者预后应有积极意义. 【参考文献】 1Liebold A, Rang CM, Philippi A, et al. Pumpless extracorporeal lung assist experience with the first 20 7casesJ . Eur J Cardiothoracic Surg, 2000, 17:608-613. 2Takeda S, Nakanishi K, Inoue T. Delayed elevation of plasma endothelin1 during unilateral alveolar hypoxia without systemic hypoxemia in humansJ. Acta Anaesthesiol Scand, 1997, 41(2): 274-280. 3Lukaszewicz AC, Mebazaa A. Lack of alteration of endogenous nitric oxide pathway during prolonged nitric oxide inhalation in intensive care unit patientsJ. Crit Care Med, 2005,33(5):1008-1014. 4Macdonald PD, Paton RD. Endothelin1 levels in infants with pulmonary hypertension receiving extracorporeal membrane oxygenationJ. J Perinat Med, 1999, 27(3): 216-220.
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