Cell Membranes 细胞膜 Summary 概述 Chemical Methods 机械破碎 mechanical disruption 非机械破碎 细胞破碎技术细胞破碎技术 概述 有些目标产物不在发酵液中 而是存在于生物体 中 尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质不 会被分泌到发酵液中 而是在细胞内沉积 使胞 内产物释放出来一般需要破碎细胞壁 分 类 机械法非机械法 固体剪切法 珠磨法 酶溶法 液体剪切法化学降解法 酸碱法 撞击击法表面活性剂剂法 超声法干燥法 渗透法冻冻融法 本节主要研究的是革兰氏阴性原核生物 其细胞结构中没有细胞核 基因物质位于单链DNA上 典型的生物是大肠杆菌 是生物技术研究的主体 通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物 细胞膜 Gram negative procaryotes 革兰氏阴性原核生物 E coli 革兰氏阴性细胞结构有三层 最外层约8mm厚 酶大多数 镶嵌在这层膜上 革兰氏阳性原核生物缺少最外层结构 但有第二层肽聚糖层和胞浆空间 第三层为浆膜层或内膜层 革兰氏阴性菌和革兰氏阳性 都有这一结构 该层主要由磷脂组成 还有分散的蛋白 质分子和金属离子 这三层有不同功能 外层及肽聚糖层使细 胞有一定的机械强度 破坏该层是本章讨 论的重点 浆膜层和细胞内膜控制细胞的 渗透压 即将营养物质运送到细胞内 将 代谢物排出胞外 真核细胞 具有真正的细胞核 其结构要比 原核生物复杂的多 以图所示的酵母菌为例 和原核细胞一样 真核细胞也具有一层细 胞膜 动物细胞 植 物 细 胞 模 式 图 破壁难易程度 与壁强度 壁厚度 聚合物的种类 细胞的形状和大小有关 细菌比真菌易破碎 G 用溶菌酶 G 添加EDTA 除去Ca2 细胞破碎理论 1 细胞破碎 A 压撞 B 剪切 C渗透 冻胀 D 破壁破 膜 2 产物释放 方法技术原理效果成本举例 机械法匀浆法 片型 细胞被搅拌器劈碎适中适中动物组织及动 物细胞 研磨法细胞被研磨物磨碎适中便宜 超声波法用超声波的空穴作 用使细胞破碎 适中昂贵细胞悬浮液小 规模处理 匀浆法 孔型 须使细胞通过的小 孔 使细胞受到剪 切力而破碎 剧烈适中细胞悬浮液大 规模处理 珠磨破碎法细胞被玻璃珠或铁 珠捣碎 剧烈便宜细胞悬浮液和 植物细胞的大 规模处理 一 机械法一 机械法 高速珠磨机 珠直径 数量 悬浮液浓度 搅拌速度 珠磨法 WSK卧式高效全能珠磨机 Crushing in ball mill 珠磨法 ZM系列卧式密闭闭珠 砂 磨机 高压匀浆器 影响因素 操作压力p p R 温度 2 C 10MPa 破碎次数N N R 温度 比速度k与温度有关 温度 25 C k 1 5倍 细胞种类 如大肠杆菌比酵母易破碎 超声波破碎 15 25kHz 机理 在超声作用下产生的空穴化作用 cavitation 空穴的形成和闭合产生极大 的冲击波和剪切力 发声器和换能器 高频电流 机械振动 功率 工作时间 9S 间歇时间 工作次数 产热大 实验室 Ultrasonication 超声波 超声波破碎仪 超声破碎法 超声破碎法 优点 适合于多种细胞的破碎 缺点 A 影响因素多 如振幅 黏度 表面 张力 液体体积和流速 探头材料和形状 B 有效能量的利用率低 C 产热大 需控温 D 不易放大 仅应用于实验室 规模的细胞破碎 JJ 2组织捣 碎匀浆机 研钵 机械法 优点 A 在大规模cell破碎中 高压匀浆机和珠磨机用得 最多 B 高压匀浆机最适合于酵母和细菌 C 珠磨机可用于酵母和细菌 但对真菌菌丝和藻 类更合适 二 非机械法 方法技术原理效果成本举例 化学法渗透冲击渗透压破坏细胞温和便宜血红细胞的破 坏 酶消化法细胞壁被消化 使 细胞破碎 温和昂贵 增溶法表面活性剂溶解细 胞壁 温和适中胆盐作用于大 肠杆菌 脂溶法有机溶剂溶解细胞 壁并使之失稳 适中便宜甲苯破碎酵母 细胞 碱处理法碱的皂化作用使细 胞壁融解 剧烈便宜 化学法 Osmotic Shock 渗透冲击法 最简单的是渗透冲击法 此法将一定体积的细胞液加到2倍体积的水 中 细胞中溶质浓度高 水不断进入细胞 使细胞膨胀 最后导致破裂 释放胞内 物 细胞破碎的难易决定于其类型 红血球细 胞容易溶破 动物细胞只有当其组织被机 械切碎或匀浆后才易溶破 植物细胞很难 溶破 因为植物细胞中含有大量的木质成 分 通过渗透流很难渗透 渗透流的动力来自渗透压 渗透压可以通 过化学平衡来估算 P RTC 该式称为范特苛夫定律 许多细胞内溶质浓度大约为0 1M NaCl 或0 2M溶质 例 一种耐盐细胞其能积累细胞内低分子 量卤化物 适应高渗透压 能在含有 0 32mol LNaCl 0 02mol LMgCl2 0 015mol LCaCl2 0 01mol LFeCl3 的培养基 中培养 当其从含盐量高的培养基中转移 至清水中 在数分钟内能将胞内产物释放 出来 试估计细胞膜所受渗透压的大小 设操作温度为25 解 细胞所受渗透压按照下式计算 P RTC 8 314 298 0 32 2 0 02 3 0 015 3 0 01 4 103 1 94 106 Pa 酶解法 阳性菌 溶菌酶 分解糖苷键 低渗溶液破裂 阴性菌 EDTA 溶菌酶 甘氨酸 溶菌酶 青霉素法 抑制细胞壁合成 酵母菌 蜗牛酶 纤维素酶 霉菌 几丁质酶 壳聚糖酶 自溶作用 加热 干燥诱发 冻 融法 细胞 15 冷冻 室温融化 细胞膜疏水键破裂 胞内水结晶膨胀破裂 温和 破碎率低 干燥法 细胞膜渗透性改变 易抽提 丙酮 丁醇 空气干燥 酵母 25 30 热空气 真空干燥 细菌 喷雾 冷冻干燥 不稳定生化物质 非机械法 优点 A 产品释放的选择性 B 提取速度和收效高 C 产品的破坏小 D 对外界环境 如pH和温度等要求低 机械法和非机械法的比较 机械破碎法缺点 A 高能 高温 高噪音 高剪切力 四高 易使产品变性 失活 B 非专一性 胞内产物均释放 分离纯化困难 C 细胞碎片大小不一 难分离 非机械破碎法缺点 A 引起新的污染 尤其是其他化学方法 B 一般只有有限的破碎 常需与其他物理法连用 细胞破碎的评价 破碎率定义 N0 原细胞数 N 破碎后残存的正常细胞 N0和N的可 通过直接计数和间接计数法得到 直接计数法 方法 样本稀释 染色 上样 计数 计算 同上 优点 方法简单 缺点 A 计数时间长 B 细胞聚集时 不利计数 C 染色误差 细胞破碎的评价 间接计数法 方法 样本离心 取上清液 测特定蛋白质或酶 与理论的最大值比较 紫球藻细胞 藻红蛋白 计算 Y 100 R Rm Rm 理论最大值 R 实验测得值 优点 A 方法客观可靠 尤其对蛋白质和酶 B 有多种 选择的指标 胞内位置 如胞膜 胞壁 近胞膜蛋白等 灵活性大 缺点 影响因素多 如温度 pH值 剪切力 溶液的稀释等 解决办法 筛选相对稳定和恒定的指标 基因工程表达产物 存在的问题 A 包含体 B N 端多一个蛋氨酸残基 表达产物未糖基化 大肠杆菌 C 表达产物过度糖基化 目标产物变成抗原 酵母 D 大肠杆菌的内毒素 包含体 一般步骤 A 包含体的分离 B 包含体溶解 变性 还原 一般用尿素 盐酸胍 SDS C 变形蛋白质的复性 D 一般的分离纯化 基因工程表达产物 例 人 干扰素的后处理工艺 发酵液 离心 发酵液冷却至10 C以下 4000r min离心10min 菌体 细胞破碎 1倍体积细胞 10倍体积 buffer 冰浴超声破碎 5次 30s 次 4000r min离心30min 洗涤 0 1 Triton X 100溶液 1000r min离心20min 重复三次 包含体 提取变性 包含体 8M 尿素 pH 8 0 50mM Tris HCl buffer 0 2 mM EDTA 10mM DTT室温搅拌2h 离心 15000r min 30min DTT二硫苏糖醇 用于蛋白质二硫键的裂解 基因工程表达产物 变性液 稀释 取1份变形液 99份上述buffer 不含DTT 使尿素 浓度小于0 1M 4 C下搅拌24h 复性液 浓缩 用截留10000D的超滤器浓缩100倍 透析后离心 15000r min离心30min 浓缩上清液 Sephacryl s 200柱层析分离 层析柱2 100cm pH 8 0 50mM Tris HCl buffer 平衡洗脱 收集主峰 冻干 终产物 纯度可达100 DNA及热源合格