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1柔红霉素、盐酸多柔比星和盐酸表柔比星的 HPLC分析作者:石涛 陈莎莎 朱宇鹏 尚广东 【摘要】 目的:建立柔红霉素、盐酸多柔比星和盐酸表柔比星的高效液相色谱分析方法。方法:色谱柱为 Agilent HC-C18(250 mm4.6 mm ,5 m);柱温为 30 oC;流速为 1.0 mLmin-1;流动相为十二烷基硫酸钠溶液-乙腈- 甲醇(50050060,用磷酸调 pH 2.2);检测波长为 254 nm。结果:柔红霉素保留时间 19.7 min,盐酸多柔比星保留时间 10.9 min,盐酸表柔比星保留时间 12.4 min;三种化合物进样量在 0.1 2 g 范围内与峰面积积分值呈良好线性关系;平均回收率为 98.4 %99.0 %,RSD 为 0.45 %(n=5);结论:本方法灵敏度高、准确,可以对盐酸多柔比星类化合物进行定性定量分析。 【关键词】 柔红霉素;盐酸多柔比星;盐酸表柔比星;高效液相色谱法 【Abstract】 Objective: To establish a HPLC method for the analysis of Daunorubicin, Doxorubicin and Epirubicin. METHODS: The determination was performed by HPLC using 2Agilent HC-C18 column (250 mm x4.6 mm ,5 m) with the column temperature maintained at 30 oC. The mobile phase consisted of SDS-acetonitrile-methanol (50050060, ajust pH 2.2 with H3PO4)at a flow rate of 1.0 mLmin-1 and a UV detection wavelength of 254 nm. RESULTS: The Daunorubicin retention time is 19.7 min ,the Doxorubicin retention time is 10.9 min ,the Epirubicin retention time is 12.4 min; The linear range of the three compounds were 0.1 2 g,and the average recoveries of all stood at 98.4 %99.0 % and RSD at 0.45 %( n = 5 each); CONCLUSION: This method is sensitive, accurate, and it can be used for the qualitative and quantitative analysis of Daunorubicin, Doxorubicin and Epirubicin. 【Key words】 Daunorubicin; Doxorubicin; Epirubicin; HPLC 柔红霉素和盐酸多柔比星为蒽环类抗生素1,盐酸多柔比星是柔红霉素的 C-14 位的羟化产物 2,盐酸多柔比星氨基糖部分 4位异构化得到活性相当、但毒性减少的盐酸表柔比星3,是联合国世界卫生组织推荐的治疗肿瘤化疗的基本药物,在国际和国内市场同类药物中占有较大的份额。目前盐酸多柔比星类化合物主要是通过化学半合成法4,问题是化学合成目标产物时可能含有其他的组份,质量控制需要各组份精确分析,因此定性和定量分析就很重要。32005 版药典中有介绍盐酸多柔比星类化合物的分析方法,但没有柔红霉素、盐酸多柔比星和盐酸表柔比星三种化合物的分析方法,故参照有关文献5,以高效液相色谱法建立盐酸多柔比星类化合物的分析方法。 1 材料 1100 型高效液相色谱仪包括包括 G2170AA 型 PC 化学工作站、G1311A 型四元梯度泵、G1314A 型可变紫外检测器(美国Agilent 公司) ;ALC-1100.4 精密天平(Sarforius 公司) ;KQ250DB 型数控超声波清洗器(昆山超声仪器厂) 。柔红霉素(柔红霉素标准品,中国药品生物制品检定所,批号:130559200501) ,盐酸多柔比星(Sigma 公司,批号:038K1349) ,注射用盐酸表柔比星(盐酸表柔比星样品,浙江海正药业股份有限公司,批号:090803) ;甲醇、乙腈为色谱级,水为重蒸馏水,其它试剂均为分析纯。 2 方法与结果 2.1 色谱条件: 色谱柱:Agilent HC-C18 (250 mm4.6 mm ,5m);柱温:30 oC;流速:1.0 mLmin-1;流动相:十二烷基硫酸钠溶液(1.44 g+0.68 mL H3PO4+H2O+500mL, 用磷酸调 pH 2.2)- 乙腈-甲醇(50050060),检测波长 254 nm;进样体积 20L。结果,在此条件下柔红霉素与盐酸多柔比星、盐酸表柔比星色谱峰可基线分离,柔红霉素保留时间 19.7 min,盐酸多柔比星保留时间 10.9 min,盐酸表柔比星保留时间 12.4 4min。该条件的建立为盐酸多柔比星类化合物进行定性分析奠定了基础(色谱见图 1) 。 2.2 样品溶液的制备: 称取柔红霉素、盐酸多柔比星和盐酸表柔比星样品各 1 mg,用水溶解配置各自储存液 1 mgmL-1即1gL -1。 2.3 线性关系的考察:精密吸取样品溶液2.5、5、10、25、50、100L ,分别置于 1.5 mL eppendorf 管中,用流动相稀释至 1 mL,摇匀,精密吸取系列溶液各 20L,注入液相色谱仪,测定峰面积。以进样量(X,g)为横坐标,峰面积的积分值(Y)为纵坐标进行线性回归,得到回归方程及线性范围,回归方程的建立为盐酸多柔比星类化合物的定量分析奠定基础。结果见表 1。 图 1 高效液相色谱 A.柔红霉素;B.盐酸多柔比星;C. 盐酸表柔比星;D.三种标准品的混合物:1,盐酸多柔比星; 2,盐酸表柔比星; 3,柔红霉素 表 1 回归方程及线性范围 2.4 最低检测限测定: 将样品溶液逐步稀释,直至信噪比(S/ N) 3 ,此时的进样浓度即为检测限。以 S/ N = 3 :1 确定的柔红霉素、盐酸5多柔比星、盐酸表柔比星的最低检测浓度均为 2.5gmL-1,检测限为 50 ng。 2.5 稳定性试验: 取同一样品溶液, 分别在 0 、2 、4 、6 、8 、12 、24 h 测定峰面积。结果,柔红霉素、盐酸多柔比星、盐酸表柔比星 RSD 均2.0% ,表明供试品溶液在 24h 内稳定性良好。2.6 精密度试验:取柔红霉素、盐酸多柔比星和盐酸表柔比星样品各 1mg ,按“2.2”项下方法制备样品溶液,吸取 20L 注入液相色谱仪,重复进样 6 次,按上述色谱条件测定峰面积。结果,柔红霉素、盐酸多柔比星、盐酸表柔比星 RSD 均2.0% ,表明方法精密度良好。 2.7 重现性试验:取柔红霉素、盐酸多柔比星和盐酸表柔比星样品,精密称取 6 份,每份约 1mg,按“2.2” 项下方法制备样品溶液,吸取 20L 注入液相色谱仪, 按上述色谱条件测定。结果,柔红霉素、盐酸多柔比星和表阿霉 RSD 均 10.0 %表明方法重现性良好。2.8 加样回收率试验: 取柔红霉素、盐酸多柔比星和盐酸表柔比星样品 5g 各 5 份,分别加入一定量的水溶解,用旋转蒸发仪40oC 蒸馏浓缩,加 500L 水洗出,按上述色谱条件测定峰面积,对照线性回归方程计算样品的回收率,结果见表 2。 表 2 加样回收率试验结果(n=5) 63 讨论 目前,采用 HPLC 法分别测定柔红霉素、盐酸多柔比星和盐酸表柔比星文献报道较多,但采用同一个色谱条件来测定这 3 种化合物未见报道。本试验发现:Agilent HC-C18 柱,柱温 30oC,流速 1.0mLmin-1,流动相 SDS-乙腈-甲醇(50050060,用磷酸调 pH2.2),检测波长 254 nm,3 种化合物分离效果很好。初步分析原因在于三种化合物的结构差异性:盐酸多柔比星比柔红霉素 C-14 位多了一个羟基,加大了盐酸多柔比星的极性,其保留时间要早于柔红霉素;盐酸表柔比星是盐酸多柔比星结构的异构化,保留时间肯定与盐酸多柔比星不一致。同时用磷酸调 pH2.2 使呈弱酸性能够提高柱效及分离度。本方法准确、灵敏度高、重现性好、可用于盐酸多柔比星类化合物的定性定量分析,盐酸多柔比星制剂的质量控制。 参考文献 1 Hutchinson CR. Biosynthetic Studies of Daunorubicin and Tetracenomycin CJ. Chem Rev,1997,97(7):252536 2 Gallo MA, Ward J, Hutchinson CR. The dnrM gene in Streptomyces peucetius contains a naturally occurring frameshift mutation that is suppressed by another locus outside of the daunorubicin-production gene clusterJ. Microbiology, 1996,142 ( Pt 2):26975 3 胡友佳,朱春宝,朱宝泉. 代谢工程研究及其在柔红霉素产生7菌中的应用J.中国医药工业杂志, 2007,38(3):164169 4 Madduri K, Kennedy J, Rivola G, et al. Production of the antitumor drug epirubicin (4-epidoxorubicin) and its precursor by a genetically engineered strain of Streptomyces peucetiusJ. Nat Biotechnol,1998,16(1):6974 5 国家药典委员会编. 中华人民共和国药典(一部) S.2005 年版. 北京:化学工业出版社,2005:505505,557558
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