1核因子 B 在原代神经细胞缺血再灌注的表达作者：田晔，万琪，刘勇红，李力 【关键词】 再灌注损伤 【Abstract】 AIM: To explore the expression of nuclear factor NFB in primary cultured mouse fetus neurons. METHODS: The neurons primarily cultured in vitro after ischemialike reperfusion, and the expression of NFB was assayed by immunofluorescence and flow cytometry. RESULTS: Immunofluorescence results showed that the expression of NFB increased and moved from cytoplasm to nuclear. Flow cytometry results showed that the expression of NFB was 1.28% (before ischemiareperfusion) and 38.72% (after ischemiareperfusion). CONCLUSION: NFB exits in neural cells and after ischemiareperfusion injury it will be activated, move from cytoplasma to nuclei and play a regulatory role of gene transcription. 【Keywords】 NFB; neuron; reperfusion injury 【摘要】目的： 观察核因子B（nuclearfactorB，NFB）在胎鼠原代神经细胞中的表达及转2移情况并讨论其意义. 方法： 体外培养的原代神经细胞经类缺血处理后再复氧,用免疫荧光抗体染色、流式细胞仪检测 NFB 的表达. 结果： 免疫荧光抗体染色显示，缺血再灌注后 NFB 表达增高并由胞质转入胞核，流式细胞仪检测示缺血再灌注前后 NFB 的表达分别为 1.3%和 38.7%，有显著性差异（P0.01）. 结论： NFB存在于神经细胞内，缺血再灌注后 NFB 被激活并由胞质转入胞核，发挥其基因调控作用. 【关键词】 核因子 B；神经元；再灌注损伤 0 引言 核因子 B（nuclearfactorB, NFB）是一种重要的转录因子，存在于真核细胞中，参与许多基因的表达调控. 静息状态下，NFB 与抑制蛋白（inhibitorB, I B）形成复合体，以无活性形式存在于胞质中. 当细胞受刺激后，NFB 活化，进入细胞核与相应靶基因结合，可表达各种粘附分子、组织因子、一氧化氮合酶等1-3. Howard 等4用体外培养的人脑微血管内皮细胞（HBMEC ）缺血再灌注后，发现 NFB 表达均上调. 我们采用体外培养的胎鼠原代神经细胞,参照 Mitani 等5建立的神经元类缺血方法, 对其类缺血后再复氧并进行免疫荧光染色、流式细胞仪检测. 观察 NFB 在神经元中的表达及其分布情况，证实其被激活后胞质转入胞核的过程. 1 材料和方法 31.1 材料孕 15 d 昆明种二级孕鼠由第四军医大学实验动物中心提供. 胎牛血清由杭州四季青公司提供，DMEM 由 Gibco 公司提供，胰酶由华美公司提供. 兔抗鼠 NFB p65 多克隆抗体（识别1286 氨基酸序列）由美国 Santa 公司提供,异硫氰酸荧光素(flourescern isothiocyanate,FITC)标记羊抗兔 IgG 由华美公司提供,CO2 培养箱由 SANYO 公司提供. 1.2 方法 1.2.1 细胞培养取孕 15 d 昆明种二级孕鼠，引臼脱颈处死,消毒后，无菌操作，取出胎鼠,暴露胎鼠脑部,显微镜下分离胎鼠大脑皮质, 剪碎脑组织, 经 125 mgL-1 胰酶消化(37, 15 min),离心 1000 rmin-1, 10 min, 弃上清,200 mLL-1 胎牛血清的 DMEM 终止消化,以完全培养基(10 mLL-1 胎牛血清 ,青、链霉素 1105 UL-1)稀释至 7108L-1 密度并接种于经多聚赖氨酸处理过的专用培养皿和培养瓶,送 入 50 mLL-1 CO2 的培养箱, 37,培养 48 h 后,加入阿糖胞苷(5 mgL-1)以抑制非神经元的继续生长,每隔 48 h 半量换液, 培养 10 d 后,可见典型的神经元，经 tubulin 免疫荧光染色显示 80%以上细胞为阳性，可认为是纯神经元培养，进行后续实验. 1.2.2 类缺血模型建立细胞培养基换为不含糖的人工脑脊液，4其组成为(mmolL-1)：NaCl 123; KCl 3.75; KH2PO4 1.25; NaHCO3 26; MgCl2 1; CaCl2 2；葡萄糖 10； pH 7.4:温度保持在(302) ，混合气体换为含 80 mLL-1 CO2 的氮气6. 类缺血处理 10 min,将人工脑脊液更换为培养基放回孵箱行再复氧. 1.2.3 免疫荧光抗体染色将类缺血处理后再复氧 30 min 的神经细胞分为一组即缺血再灌注组,另设一组为未缺血组. 再设一组单加抗，作为非特异性结合对照. 各组分别加 1200 稀释后的兔抗鼠 NFB p65， 4 ， 24 h. 10 mmolL-1 PBS 洗涤，加 150 稀释后的 FITC 标记的羊抗兔 IgG，室温 1 h；500 gL-1 缓冲甘油封片，置荧光显微镜下观察 . 1.2.4 流式细胞仪计数检测将接种于培养瓶中的原代神经细胞（1106/瓶）分为 2 组, 一组未经类缺血处理,另一组经类缺血处理后再复氧 30 min. 用 2.5 gL-1 胰蛋白酶将细胞消化成单细胞悬液,经离心洗涤后加入 1200 NFB p65 多克隆抗体 200 L，置 37 45 min，用 10 mmolL-1 PBS 洗涤离心弃上清，加入 150 FITC 标记的抗兔 IgG 200 L，置 4 45 min. 另设两组阴性对照，一组不加抗和抗，用于荧光强度的基线校正；另一组单加抗，作为非特异性结合对照，所有样品分别加入400 L 10 mmolL-1 PBS 液上机检测，并将试验重复两5次，结果取均值. 统计学处理：结果以 xs 表示，两组间比较用方差分析. 2 结果 2.1NFB p65 的表达部位免疫荧光抗体染色见未缺血组NFB p65 仅表达于神经元胞质,荧光强度(+)（Fig 1） ；缺血再灌组NFB p65 主要表达于胞核,荧光强度()(Fig 2). 2.2NFB p65 的表达率在神经元中基础表达为 1.3%,经缺血再灌注后 30 min 表达升高 ,达 38.7%（P0.01）. 非特异性结合组表达为 0.1%. 3 讨论 在体外细胞培养体系中，缺氧复氧模型能较好地模拟缺血再灌注对细胞内造成的损害. 本试验免疫荧光抗体染色表明： NFB p65 存在于胎鼠原代神经细胞中，未被激活时仅存在于胞质中，基础表达率很低，似以轴丘部表达稍高. 经缺血再灌注后，NFB p65转移入细胞核内，在胞核内表达明显增高，胞质仍有少量表达. 流式细胞仪计数检测发现体外培养的原代神经细胞未缺氧时 NFB 表达很低，经缺血再灌注后，其表达明显增高达 30 倍，这均说明在此过程中 NFB 被激活，并转入核内发挥其基因转录调节作用. 图 1 未缺血组 NFB 的表达（略） Fig 1Expression of NFB in noischemia400（略） 图 2 缺血再灌组 NFB 的表达（略） 6Fig 2Expression of NFB in ischemia /reperfusion400（略） NFB 存在于脑血管内皮细胞、神经细胞及胶质细胞中，主要定位于突触部位即可存在于突触前末端、突触后区域及核周胞质内，能快速接受外界信息，由局部突触信号诱导其活化. 活化的NFB 可由轴突逆行运输进入胞核，将突触信号传至核内，并与靶基因结合，调控基因转录，发挥其生物学作用7，8 ，是炎症、免疫、肿瘤和急性期反应的核心调控因素. 近年来有资料表明，脑缺血再灌注损伤后，NFB 活化，致多种粘附分子表达增加4，9, 中性白细胞在粘附分子的介导下向血管内皮细胞滚动、粘附并外渗,引发炎症级联反应. 造成白细胞向缺血区聚集，这种炎症反应在脑缺血再灌注神经元损伤中起重要作用. 本研究探讨了 NFB在胎鼠原代神经细胞缺血再灌注后的表达情况及由胞质转入胞核的过程，为进一步明确其在脑缺血再灌注损伤炎症机制中的意义奠定基础. 【参考文献】 1 Karin M, BenNerih Y. Phosphorlation meets ubiquition: The control of NFKb activity J. Annu Rev Immunol, 2000; 18: 621-663. 2 May MJ, Ghosh S. Signal transduction through NFKB J. Immunol Today, 1998; 19(2): 80-88. 3 Musikacharoen T, Matsuguchi T, Kikuchi T Carroll 7JE. NFKB and STAT5 play important roles in the reglation of of mouse Tolllike receptor 2 gene expression J. Immunolog, 2001; 166: 4516-4524. 4 Howard EF, Chen Q, Cheng C, Carroll JE, Hess D. NFkappa B is activated and ICAM1 gene expression is upregulated during reoxygenation of human brain endothelial cells J. Neurosci Lett, 1998; 248(3): 199-203. 5 Mitani A, Yanase H, Sakai K. Origin of intracellular Ca2+ elevation induced by in vitro ischemiclike condition in hippocampla slices J. Brain Res, 1993;601:103-110. 6 Grondahl TO, Langmoen IA. Confocal laser scanning microscopy used to monitor intracellular Ca changes in hippocampal CA1 neurons during energy deprivation J. Brain Res, 1998; 785:58-65. 7 Stephenson D, Yin T, Smalstig EB,Hsu MA, Panetta J,Little S, Clemeus J. Transcription factor nuclear factorkappa B is activated in neurons after focal cerebral ischemia J . J Cereb Blood Fl