1比较两类树突状细胞激活的肿瘤特异性 CTL 对肝癌荷瘤裸鼠的治疗作用作者：张希国，师建国，刘彦仿，阎庆国 【摘要 】 目的 研究人外周血不同来源的树突状细胞（dendritic cells，DC）光镜形态学、细胞超微结构及体内外诱导抗肿瘤免疫反应的差异。方法 联合应用粒/巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF) 、白介素4 （IL4 ）及肿瘤坏死因子（TNF）从人外周血中培养出两类 DC；人肝癌细胞系 SMMC7721 细胞的可溶性肿瘤抗原刺激两类 DC；两类 DC 激活同源的 T 淋巴细胞；观察两类 DC 激活的T 淋巴细胞分别抑制已接种于裸鼠的人肝癌细胞系 SMMC7721 移植瘤生长。结果 细胞因子诱导的人外周血 DC 群可见到两类 DC 亚群：一类可能来自 DC 前体细胞，另一类是由单核细胞分化来的DC；两类 DC 体外激活的 T 淋巴细胞能分别抑制肝癌细胞系SMMC7721 裸鼠移植瘤生长。结论 细胞因子诱导的人外周血DC 群存在多相性，两类 DC 亚群体内外诱导的抗肿瘤细胞免疫反应不仅能抑制肝癌细胞系 SMMC7721 裸鼠移植瘤发生，而且抑瘤率不同，提示两类 DC 亚群在肝癌的治疗中发挥着不同的作用。 【关键词】 树突状细胞；肝癌；肿瘤免疫；裸鼠2Antihepatocarcinoma Therapeutical Effect of Tumor Special CTL Activated by Two Kind of Dendritic Cells in Nude MiceKey words：Dendritic cells；Hepatocellular carcinoma；Tumor immunity；Antitumor vaccine树突细胞(dendritic cells, DC) 是目前已知的功能最强的抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APC)，可以在体内外向 T 淋巴细胞提呈抗原，并诱发 CTL(细胞毒 T 淋巴细胞)反应。选择人外周血体外培养富集 DC 是研究 DC 的重要途径，但所面临的困难是 DC在外周血中含量极微，而且 DC 的多源性和多功能性尚待进一步阐明。本实验我们借助于细胞因子诱导体外培养富集人外周血含量达70%80% DC 群，经形态学鉴定为两种 DC 群。体外分别诱导出针对肝癌细胞抗原的特异性，并用于荷瘤裸鼠的治疗以观察其抑瘤率的效果。1 材料与方法1.1 材料3重组人粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子（rhGMCSF ） ，重组人白细胞介素4 （rhIL4 ） 、CD86(Sigma 公司） ，重组人肿瘤坏死因子（rhTNF ） （校肿瘤研究所馈赠） ，淋巴细胞分离液（上海华精生物科技有限公司） ，RPMI1640 、新生小牛血清（杭州四季青公司） ，MTT（华美生物工程公司） ，5 周龄雌性 BALB/c 裸鼠中国科学院上海实验动物研究所，动物饲养及实验在校实验动物中心（SPF 级动物实验室）完成，健康人外周血（附属医院输血科） 。1.2 方法1.2.1 DC 的体外培养及收集 据文献略作修改1 ，人外周血单个核细胞（PBMNC）以合适的密度接种于培养瓶内，适宜条件培养2h 后收集未贴壁细胞（97%以上 T 淋巴细胞，收集另培养） ，继续培养 24h 后按 3106 细胞/10ml 培养瓶分组：将释放下来的悬浮细胞作为 A 组，仍然贴壁的细胞作为 B 组，A 组及 B 组细胞均在含终浓度为 500u/ml 的 rhGMCSF（1 000u/ml）及rhIL4（500u/ ml）的上述 RPMI1640 完全培养液中培养，A 组及 B 组均于培养第 3d 向培养瓶中添加 rhTNF（终浓度 500u/ml） ，每天半量换液，每隔 3d 全量换液（含上述 3 种细胞因子的培养液） ，于培养第 9d 收集 DC 群。1.2.2 两类 DC 亚群的透射电镜观察细胞超微结构 于培养第 124天收集足量 A、B 两组 DC 群,经 PBS 液洗 2 次后低速离心获细胞沉淀，经固定、脱水、包埋、超薄切片复染后，透射电镜观察并照相。1.2.3 两类 DC 亚群活化的 T 淋巴细胞对肝癌细胞的特异性杀伤 分别收集活化后的淋巴细胞，按每孔 5105、2.5105、5104 做效应细胞，靶细胞分别为 SMMC7721 细胞、hepG2 细胞。靶细胞浓度为每孔 5105。同时做效应细胞和每种靶细胞的对照各 3 复孔。效应细胞与靶细胞混合培养 16h 后加入 5mg/ml MTT10l 继续培养 8h。离心培养板（2 000r/min，10min） ，弃去上清液，每孔加 DMSO100l，于 570nm 处测定 A 值计算各自实验结果。1.2.4 荷瘤裸鼠模型的建立 收集对数生长期的 SMMC7721 细胞，接种于裸鼠背部皮下，2106/只，抑瘤率由治疗初始肿瘤重量治疗结束时肿瘤重量/治疗初始肿瘤重量来表示。1.2.5 两类 DC 亚群诱导的肿瘤抗原特异性 CTL 治疗荷瘤裸鼠模型 15 只裸鼠中全部长出肿瘤。随机挑选 5 只荷瘤鼠为 A 群 DC 活化的肿瘤特异性 CTL1 治疗组，另选 5 只作为 B 群 DC 活化的肿瘤特异性 CTL2 治疗组，最后 5 只为阴性对照组。1.2.6 统计学方法 实验结果采用 SPSS 统计软件进行方差分析。52 结果2.1 人外周血来源的两类 DC 亚群的形态特征观测 在倒置显微镜下观察，A、B 两组培养第 34d 时可见大部分细胞呈梭形，细胞表面呈毛刺状，细胞大小约为单核细胞的 11.5 倍， A、B 两组细胞在数量及形态上无显著差异。2.2 两类 DC 亚群细胞超微结构 将体外培养第 12d 的 A、B 组DC 群样本在透射电镜下观察，从亚细胞器的超微结构特征来看，DC 群含两类 DC：一类 DC 亚群在 A 组多见，其细胞表面有大量树枝状突起，细胞核形状不规则，核内异染色质沿核边高度凝聚，胞质中线粒体相当丰富，溶酶体、粗面内质网、胞饮小体数量少或无，见图 1a、b，这类 DC 中个别细胞表面树突粗大者，其胞浆内核糖体及光面内质网清晰可见，部分内质网扩张或有些线粒体膨胀，见图 1c，提示这些细胞活动度大、供能旺盛，我们分析这类 DC 可能源自 DC 前体细胞;另一类 DC 群在 B 组皆是，其细胞结构特征为细胞呈不规则形，细胞表面粗糙，有大量皱褶及粗大树枝结节状突起，细胞核常呈肾形或马蹄形，核内异染色质边集， 胞浆内线粒体比第1 类 DC 群相对少，高尔基体及板层溶酶体较多，见图 2a、b 、c，我们分析这些可能是由单核细胞分化来的 DC 的超微结构特征。表1 两类 DC 亚群活化的 CTL 对 SMMC7721 表 2 两类 DC 诱导的6CTL 对 SMMC7721 移植廇抑瘤率的影响2.3 两类 DC 亚群活化的淋巴细胞对肝癌细胞的特异性杀伤 负载肝癌 SMMC7721 细胞可溶性抗原后两类 DC 亚群活化的 T 细胞，对 SMMC7721 细胞、hepG2 细胞均有不同程度的杀伤作用，见表 1，杀伤效果明显高于非特异性淋巴细胞对照组且由 B 群 DC活化的 CTL2 治疗组的杀伤效果高于由 A 群 DC 活化的 CTL1 治疗组的杀伤效果。2.4 肝癌荷瘤鼠模型的建立 在接种后的 7 天内 15 只裸鼠全部长出肿瘤，荷瘤鼠平均重量变化及肿瘤平均重量，见表 2。2.5 两类 DC 亚群诱导的肿瘤抗原特异性 CTL1、CTL2 对荷瘤裸鼠模型的治疗作用观察 以被激活的 CTL 治疗裸鼠已生长出的SMMC7721 移植瘤，接种后的第 35 天对照组、A 群 DC 诱导的CTL1 治疗组及 B 群 DC 诱导的 CTL2 治疗组裸鼠的体重变化、移植瘤的重量变化、及抑瘤率，见表 1。其生长曲线，见图 3。结果显示与对照组相比，CTL1 治疗组及 CTL2 治疗组移植瘤生长均受到不同程度抑制（P0.05，P0.01） 。在两治疗组中，CTL2 治疗组移植瘤生长受到抑制更明显（P0.05） 。3 讨论7鉴于 DC 是免疫系统中一类最重要的抗原提呈细胞（APC） ，在启动 T 细胞免疫应答和 T 细胞依赖性应答中起关键作用，近年来对DC 的临床研究愈来愈令人瞩目 24。我们观察到人外周血 PBMNC 经移弃大部分 T 细胞后，再于RPMI1640 完全培养液中继续培养 24h 获取贴壁单核细胞CD14+ ，经细胞因子联合刺激培养获取的 DC 群变为 CD14并诱导分化为两类 DC 亚群，借助于透射电镜观察到，从 A、B 两组人外周血富集的 DC 群（尤其是 B 组 DC 群）中相当一部分 DC 的胞膜和胞浆近膜侧有许多清晰可见的溶酶体，显示 DC 具有饱饮活性，这可能提示 B 组 DC 群抗肿瘤的能力更强。单核 巨噬细胞和 DC具有高度的派生、表型、功能和分子可塑性，它们源自骨髓中共同的多能造血祖细胞5。有文献报道，由 CD34+细胞分化而来的DC（CD34+ progenitor cellderived DC，PCDC) 和由单核细胞衍生来的 DC(monocytederived DC，MoDC) 的功能性质所有不同， PCDC 可能比 MoDC 更适合用于肿瘤的免疫治疗 6。两类 DC 亚群，经 SMMC7721 细胞的可溶性抗原刺激后在体外诱导自体 T 淋巴细胞分别产生 CTL，两类 DC 亚群诱导的 CTL 对SMMC7721 细胞与 hepG2 细胞杀伤率差异性说明两类 DC 亚群诱导的 CTL 存在差异性和较高的特异性，进一步在荷瘤裸鼠模型进8行治疗性研究发现，B 组 DC 群诱导的 CTL 具有显著的抑瘤效应，与 A 组 DC 群治疗组诱导的 CTL 及对照组相比，差异具有显著性。体内实验产生抗肿瘤效应结果与体外实验的结果一致。本研究结果为我们进一步从人外周血分离富集 DC，采用抗原特异性 DCs 激发肿瘤抗原特异性自体 T 细胞并输注给肿瘤患者的过继免疫疗法提供了新思路，值得进一步研究7，8 。【参考文献】 1 王坤，吴一龙，周清，等. 临床级树突状细胞的分离和培养J. 肿瘤防治研究杂志，2004，31(8)：458460.2 Holtl L, ZelleRieser C, Gander H, et al. Immunotherapy of metastatic renal cell carcinoma with tumor lysatepulsed autologous dendritic cellsJ. Clin Cancer Res, 2002, 8(11): 33693376.3 Tang ZH, Qiu WH, Wu GS, et al. The immunotherapeutic effect of dendritic cells vaccine modified with interleukin18 gene and tumor cell lysate on mice with pancreatic carcinoma J. World J Gastroenterol, 2002, 8(5): 908912.94 Terasawa H, Tsang KY. Identification and characterization of a human agonist cytotoxic Tlymphocyte epitope of human prostatespecific antigen J. Clin Cancer Res, 2002, 8(1): 4153.5 Shortman K.Burnet oration：dendr