1氨甲喋呤联合咖啡因对骨肉瘤细胞株的作用观察【摘要 】 目的观察氨甲喋呤联合咖啡因对骨肉瘤细胞株的作用。 方法以国人骨肉瘤细胞株 OS-732 细胞为研究对象，根据析因试验设计原因，设 1 无药组（阴性对照组） ，2 咖啡因组，3 氨甲喋呤组，4 咖啡因、氨甲喋呤联合用药组（混合用药组） 。培养一段时间后，分别采用 MTT 法细胞毒性试验和流式细胞仪（FCM）分析，观察 3 组药物对细胞的毒性（用残存细胞吸光度 A 值表示）及细胞周期的影响。 结果FCM 分析各组于 48 h G2/M 期细胞比例（%）为 1 组（23.2100.416） ，2 组为（23.1200.440） ，3 组为（28.7700.531） ，4 组（23.2670.319） ，1 组与 2 组间差异无统计学意义，其余各组间差异有统计学意义（P0.01） 。各组残存细胞吸光度 A 值为 1 组（0.4110.006） ，2 组（0.4010.006 ） ；3 组（0.3040.007） ，4 组（0.1050.002） ，组间差异及交互作用有统计学意义（P0.01)。 结论氨甲喋呤与咖啡因具有协同作用，可增加氨甲喋呤对骨肉瘤细胞株的抑制率。 【关键词】 骨肉瘤； 氨甲喋呤； 咖啡因； 肿瘤细胞,培养的AbstractObjectiveTo observe whether or not caffeine can improve the cyto-toxicity effect of methotrexate (MTX) 2on osteosarcoma cell line.MethodOsteosarcoma cell(OS-732)were incubated with no drug,caffeine,MTX or MTX adding caffeine separately,and were named as control group,caffeine group,MTX group and mixing group respectively.The ratios of cells on G2M phase of each group were measured with flow cytometry after 48 h incubation and the cell inhibition ratios were measured with the MTT colorimetric analysis after 72 h incubation.ResultThe ratios(%)of cells on G2M phase were control group（23.2100.416),caffeine group（23.1200.440),MTX group（28.7700.531）and mixing group（0.1050.002）(P 0.01,except control group between caffeine group),the absorbency of survival cell(A value)were control group（0.4110.006),caffeine group（0.4010.006 ） ；MTX group（0.3040.007）and mixing group（0.1050.002）(P 0.01).Conclusion Caffeine can improve the cyto-toxicity effect of MTX on osteosarcoma cell line.Key words：osteosarcoma; MTX; caffeine; tumor cell,incubation肿瘤细胞在化疗药物作用后,有的会出现细胞周期受阻的现象，3包括 G1 停滞，S 期蓄积， G2M 期阻滞等。G2M 期阻滞被认为是细胞的一种保护性调节，可以使 DNA 受损的细胞获得充分的修复时间，从而顺利地进入下一个细胞周期，避免被诱导凋亡。咖啡因是近年来发现的肿瘤化疗增加剂，主要作用机理是缩短 G2M 期阻滞。氨甲喋呤作用于骨肉瘤细胞后会不会出现 G2M 期阻滞，加入咖啡因能否增加其细胞毒性，目前尚缺乏试验依据。1 材料与方法1.1 材 料OS-732 细胞株购于北京积水潭医院创伤骨科研究所，RPMI 1640 干粉及胰酶购于美国 Cibco 公司，氨甲喋呤购于浙江万马药业有限公司，咖啡因购于美国 Sigma 公司，FCM 美国 Coulter 公司生产，酶联免疫检测仪美国 Coda 公司生产， CO2 孵箱 Sheldon Manufacturing 公司生产，倒置显微镜重庆光学仪器厂生产，96孔培养板 Nunclon International 公司生产。1.2 方 法1.2.1 细胞培养4细胞常规培养于体积分数为 10%新生小牛血清（经 56 30 min 水浴灭活）的 RPMI 1640 培养液中，其中含有青霉素 100 IU/ml 及链霉素 100 g/ml，在 37 体积分数为 5%CO2、95%空气、饱和湿度的 CO2 孵箱内闭式培养。取传代后第 3 d 处于指数增殖期的细胞备用。1.2.2 细胞处理取生长良好的细胞，以少量胰蛋白酶将贴壁细胞消化、离心，倒去上清液，加入适量 RPMI 1640 培养液，用吸管反复吹打均匀制成细胞悬液。根据析因试验设计原理将细胞株分为 4 组，1 组无药组（阴性对照组） ；2 组咖啡因组，培养液内加入咖啡因，浓度为5.0 mmol/L；3 组氨甲喋呤组，培养液内加入氨甲喋呤，浓度为320 g/ml；4 组混合用药组，培养液内同时加入浓度为 5.0 mmol/L 的咖啡因与浓度为 320 g/ml 的氨甲喋呤。同时调整细胞浓度为 2105/ml。各组细胞加入 96 孔培养板，每组设 3 复孔，每孔 200 l。置 37 体积分数为 5%CO2、95%空气、饱和湿度的 CO2 孵箱内闭式培养，供测量各组药物的细胞抑剂率。同时各组取相同浓度的细胞悬液 10 ml 于培养瓶中在 37 体积分数为5%CO2、95%空气、饱和湿度的 CO2 孵箱内闭式培养供观察G2M 期比例。51.2.3 流式细胞仪（FCM）对细胞周期进行分析将置于培养瓶内的各组细胞于 48 h 取出，以 0.25%胰蛋白酶消化 35 min，至贴壁细胞间出现筛状间隙为止。弃去消化液，加Hanks 液。用吸管将细胞自瓶壁上轻轻吹打下来，并移入离心管中。短时低速离心（1 000 r/min，5 min)。弃上清，加冷PBS（pH 7.4)，均匀吹打，并短时低速离心 3 次（1 000r/min,5 min)以去除悬液中的细胞碎片。再次加入冷 PBS（pH 7.4)均匀吹打，制成单细胞悬液。将细胞液以 500 目尼龙网过滤，以去除重叠成团的细胞。调整细胞浓度为 1104/ml。在 4 冰箱内进行荧光染色后用流式细胞检测 G2M 期细胞百分比。每组细胞测 3 次，用SPSS 12.0 统计软件，对结果进行方差分析。1.2.4 MTT 法测定各组细胞的 A 值及抑制率72 h 后将 96 孔板取出，每孔再加 12 稀释的 MTT 应用液（5 mg/ml)20 l,继续培养 4 h 后弃除上清液，于每孔中加入 10%的二甲亚砜 10 l，振荡 5 min，直到结晶完全溶解，液体呈蓝紫色，然后在酶联免疫检测仪上以 570 nm 波长测定吸光度（A ）值。并可根据 A 值计算出各组的细胞抑制率。用 SPSS 12.0 统计软件，对结果进行方差分析，观察各组间的差异及药物间交互作用是否具有统计学意义。62 结 果2.1 FCM 分析各组 48 h G2M 期细胞所占比例（表 1）1 组与 2 组间差异无统计学意义，其余各组间差异有统计学意义（P 0.01） 。单独应用 5.0 mmol/L 的咖啡因对 G2M 期无明显影响，单独应用氨甲喋呤时出现 G2M 细胞比例增高，二者联合应用后 G2M 期细胞比例降低。表 1 各组 48 h G2M 期细胞所占比例（略）2.2 MTT 法测定各组细胞 72 h A 值（表 2）各组间差异具有统计学意义（P0.01） 。单独应用 5.0 mmol/L的咖啡因对骨肉瘤细胞有轻微影响，320 g/ml 的氨甲喋呤对骨肉瘤细胞有较大抑制作用，二者联合应用后可明显减少 A 值，对肿瘤细胞抑制作用最明显。根据统计分析二者联合具有交互作用，差异有统计学意义（P0.01） 。表 2 MTT 法测定各组细胞的 A 值（略）3 讨 论新辅助化疗的开展及新的细胞毒性药物的使用使包括骨肉瘤在内7的许多肿瘤治疗有了明显改观1 ，尽管如此，肿瘤细胞对多种化疗药物产生耐药性仍是造成化疗失败的主要原因。传统上对肿瘤耐药及逆转剂的研究主要集中在细胞膜/核膜蛋白，即药物输出泵：如P 糖蛋白（Pgp） 、多药耐药相关蛋白（ MRP）和肺耐药相关蛋白（LRP） 。已有的逆转剂大部分是针对细胞 P 糖蛋白（Pgp)，通过抑制 P 糖蛋白（Pgp)对进入细胞内化疗药物的外排作用，提高细胞内化疗药物的水平，来增加化疗药物的杀伤作用。如钙离子通道阻滞剂，环孢酶素 A 及其衍生物，抗激素类化合物等，但其效果仍欠理想。近年来研究表明，DNA 作为多种抗癌药物攻击的靶分子，其损伤修复能力异常与肿瘤耐药性的形成有着密切关系。因此，从 DNA损伤修复的研究入手，将为肿瘤治疗和耐药性逆转开辟新的途径。周期运转中的细胞有一种识别 DNA 损伤的能力，一旦出现 DNA 损伤，细胞周期就会受阻，包括 G1 停滞、S 期蓄积和 G2M 期阻滞，从而给细胞修复提供足够的时间。细胞周期素(Cyclin)为重要的细胞周期蛋白的调控基因。目前发现的 Cyclin 有 Cyclin AH。Cyclin B 主要出现在 G2M 期2 。其表达的产物细胞周期蛋白与P34cdc2 蛋白复合物被称为有丝分裂促进因子(maturation promoting factor,MPF)。在正常细胞，G2 后期 MPF 氨基酸被磷酸化或去磷酸化，从而具有激酶活性，进而诱导一系列底物(如核层蛋白，H1 组蛋白，核仁蛋白等) 磷酸化，引导核膜崩解，染色质凝8聚等有丝分裂所具有的变化。细胞通过抑制 cyclin B 表达，或抑制P34cdc2 激酶活性，使细胞不能进行有丝分裂，从而产生 G2M 期阻滞。Yao SL3等发现，咖啡因有活化受抑制的 MPF 的能力。因此可以缩短甚至取消 G2M 期阻滞，从而可以逆转肿瘤耐药。该原理在国外已经临床使用，并取得不错的临床效果4 。国内也开始对此进行研究。万双林5 等发现安全浓度的咖啡因在骨肉瘤细胞株(OS-732)顺铂热化疗中具有增效作用，并发现咖啡因能促进经顺铂热化疗后的骨肉瘤细胞由 G2/M 期向 G0/G1 期移行，导致G2/M 期缩短，细胞不能进行足够的 DNA 修复而进入分裂期，从而加速细胞死亡。李钧等6 的研究表明，咖啡因有促进顺铂诱导骨肉瘤细胞凋亡的作用。目前在临床上使用更多的 Rosen T125化疗方案，其中氨甲喋呤作用于骨肉瘤细胞后，是否出现 G2M 期阻滞，咖啡因能否缩短甚至取消 G2M 期阻滞，二者联合应用能否增加肿瘤细胞抑制率，尚未见报道。作者根据析因试验设计原因，设置 4 个实验组，用FCM 测定各组细胞于 48 h G2M 期比例，用 MTT 法来测定各组药物对肿瘤细胞作用 72 h 后残存细胞吸光度，结果显示，单纯应用5.0 mmol/L 咖啡因，对肿瘤细胞 G2M 期比例无明显影响，对肿瘤细胞有轻微抑制；单纯应用氨甲喋呤，增加 G2M 期比例，对肿瘤细胞有抑