1炎症性肠病基因治疗进展【关键词】 炎性肠疾病 基因治疗 0 引言 溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohns disease, CD)都属于炎症性肠病 (inflammatory bowel disease, IBD), 其发病可能由感染、遗传、免疫等多种因素相互作用所致. 传统观念认为通过基因转移替代缺陷基因的基因治疗只适用于致病基因明确的疾病, 目前慢性炎症性疾病和自身免疫性疾病也被纳入了基因治疗的范围,可通过基因转移使机体表达免疫相关蛋白质, 从而下调致病的炎症和免疫反应, 上调保护性反应. 相对于囊性纤维化、重症联合免疫缺陷和肿瘤, IBD 的基因治疗尚处于起步阶段. 本文就IBD 的基因治疗作一概述. 1IBD 的免疫病理机制和肠干细胞 CD 的肠黏膜炎症以 1 型辅助性 T 细胞(Th1)型 CD4+淋巴细胞占主导地位, 而 UC 则主要是由 Th2 型 CD4+淋巴细胞介导的. 尽管 CD 和 UC 发生的机制并不完全相同 ,但最终的肠壁损伤均可归咎于巨噬细胞、粒细胞等炎性细胞及其产生的炎性细胞因子. 一方面, 淋巴细胞、巨噬细胞在肠道局部聚集并释放各种促炎细胞因子, 如TNF，白细胞介素(IL)6 ，IL8 ，IL12 ，IL18 等, 其中多数与疾病活动性呈正相关; 另一方面, 抗炎细胞因子如 IL10，IL4 ，转化生长因子(TGF) 等的分泌相对不足 . 这种促炎细胞因子和抗炎2细胞因子之间的失衡促进和加剧了肠壁的炎症反应. 细胞因子失衡可由 Th1/Th2 细胞比例失衡引起, 又可反馈性地加重 Th1/Th2 细胞失衡, 形成恶性循环, 因此被视为 IBD 发病机制中的重要环节. 肠上皮细胞不断更新, 衰老的细胞脱落至肠腔, 新的细胞则由位于肠隐窝底部的干细胞不断补充, 因此位于肠腺底部的干细胞成了基因治疗的最佳靶细胞. 但是肠干细胞缺乏明确的形态学特征或理化特性, 目前还无法与其它肠上皮细胞鉴别, 因此无法直接证明目的基因已成功转移至干细胞. 给予携带目的基因的载体后, 需要对干细胞成功地进行基因修饰, 肠上皮细胞才能持久稳定地表达目的基因. 腺相关病毒(AAV) 载体能使肠上皮细胞于口服感染后 1 mo 内稳定高效地表达目的基因. 予免疫缺陷鼠静脉注射 5 型重组腺病毒(AD5)载体, 亦发现结肠上皮细胞长时间表达目的基因, 而消化道其他部位目的基因表达阴性. 肠道相关淋巴组织内的免疫细胞无疑是 IBD 基因治疗中最受关注的靶细胞, 但由于肠道黏膜上皮屏障的存在, 载体不能有效到达固有层. M 细胞是存在于黏膜集合淋巴结滤泡顶部上皮中的一种特殊细胞, 其主要功能是将肠腔内抗原和病原体跨上皮转运至上皮下淋巴组织. 可利用 M 细胞能广泛摄取各种抗原物质的功能,及其与免疫细胞之间的对话方式, 通过 M 细胞将载体导入黏膜淋巴组织, 从而调节局部黏膜免疫反应和机体的系统免疫反应 1. 有实验表明 AAV 载体能感染肠道固有层内细胞, 并使 17%19%的固有层细胞于感染后 6 mo 内持续表达目的基因. 2 目的基因转移至胃肠道组织 3实验表明2, 阻断小鼠肝动脉和门静脉后, 经眶后静脉丛予重组腺病毒载体, 30 min 后恢复肝脏血供, 肠壁血管、血管周围组织和小肠绒毛持续表达目的基因达数周之久. 局部予经包装的质粒、脂质体、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和 AAV 载体均能将目的基因转导至肠道黏膜,且黏液溶解剂( 二硫苏糖醇、 N乙酰半胱氨酸)和蛋白酶体调节剂(MG101)能促进转导效率. 上述载体中, 以 AAV 载体系统的应用前景最广阔. 重组 AAV(rAAV)载体去除了所有编码序列, 只保留 145 bp 的末端重复序列 , 不含任何病毒基因, 感染细胞后, 前病毒 DNA 定向整合至 19 号染色体的 AAVS1 区域. 在人类基因治疗的常用病毒载体中, rAAV 是目前唯一没有引起宿主病理反应的载体3. 实验表明, 以 AAV 载体对空腹大鼠灌胃 6 h 后, 胃十二指肠和近端空肠固有层细胞开始表达目的基因, 并能持续稳定表达 6 mo; 虽然未观察到结肠有目的基因表达, 但是可以推测灌肠能使目的基因被转导至结肠固有层细胞. 此外, 虽然没有直接证据表明AAV 载体能感染肠干细胞, 但除固有层外, 肠上皮细胞亦表达目的基因 1 mo. AD5 是体内实验使用最多的载体, 该载体由于 E1 缺失造成病毒复制缺陷. 腺病毒载体可高效感染多种靶细胞, 对分裂期细胞和增殖停止期细胞均有很高的导入效率, 这是逆转录病毒载体所不具备的. 据报道, 经十二指肠饲管予大鼠 E1 缺失的重组腺病毒载体后, 目的基因能有效导入十二指肠、空肠和回肠上皮细胞. 以E1/E3 缺失的重组腺病毒载体灌肠后, 结肠上皮细胞能高效表达目的基因. 而且炎症性肠病的基因治疗 AD5 载体感染 IBD 患者肠上皮4细胞的效率远高于非 IBD 患者4 . 但是经消化道予腺病毒载体主要感染的是更新速率很快的肠上皮细胞, 因此 AD5 载体转导的目的基因在肠道内的表达时间只能维持数天, 为达到治疗 IBD 的目的, 需反复给药, 同时还要避免机体的免疫反应 . 有报道称, 经尾静脉注射重组腺病毒载体后, 免疫缺陷小鼠结肠上皮细胞和隐窝细胞可长时间表达目的基因, 而消化道其他部位无目的基因表达. 该实验结果非常诱人,但由于 E1 缺失造成病毒复制缺陷, AD5 载体不能像逆转录病毒载体一样整合至宿主基因组. 3IBD 基因治疗的策略和研究现状 3.1 下调促炎细胞因子的表达 IL18是一个多功能细胞因子, 结构类似 IL1家族, 能活化 T 淋巴细胞内的核因子(NF)B 和激活蛋白(AP)1, 与 IL12诱导的 STAT4协同促进 T 淋巴细胞表达干扰素(IFN) 5 . 此外, IL18还通过上调 TNF，IL6 和IL1的表达加剧炎症反应. 以 IL18结合蛋白(IL18BP) 治疗三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的小鼠结肠炎, 可减轻肠道炎症. 鉴于 IL18在 CD 中的重要作用, Wirtz 等6 尝试以 IL18为靶点对 CD 动物模型进行基因治疗. 构建表达 IL18反义寡核苷酸的重组腺病毒载体, 予移植 CD4+ CD62L+T 淋巴细胞形成的 CB.17SCID 小鼠结肠炎模型灌肠. 蛋白质印迹分析显示表达 IL18反义寡核苷酸的重组腺病毒载体能抑制结肠组织产生 IL18, 实验组结肠炎的内镜和组织病理学改变均较对照组明显改善. 此外, 该实验还观察到局部给药方式只抑制结肠固有层单核细胞产生 IFN, 而不影响来源于脾5脏的单核细胞. 3.2 上调抗炎细胞因子的表达 IL10能抑制巨噬细胞活化和分泌IL1, IL, IL6, IL12, IL18和 TNF等细胞因子, 下调人类白细胞抗原(HLA) 类分子的表达; 通过影响抗原递逞细胞功能而强烈抑制 CD4+ T 淋巴细胞的增殖和分泌细胞因子. 此外, 其还能直接抑制 T 淋巴细胞产生 IL2，TNF 和 IL5. IL10基因敲除小鼠可自发形成 Th1 型淋巴细胞介导的结肠炎 . IL10对 IBD 动物模型有效, 对 CD 患者的临床实验结果却不令人满意, 其原因可能是肠道局部 IL10浓度过低, 起不到抑制炎症的作用, 而加大剂量又会伴随严重不良反应; 也可能是因为 IL10半衰期太短所致. 一些研究小组尝试以不同的给药方式(灌肠、经静脉和经腹腔) 评估 AD5 IL10对IBD 动物模型的预防和治疗作用,结果显示 AD5 IL10能预防实验性结肠炎的发生; 静脉给药的血 IL10浓度显著高于腹腔给药,但并不能显著提高结肠局部 IL10浓度; 灌肠给药的结肠局部 IL10浓度高于静脉给药7-10. 虽然这些研究没有得到预期的结果 , 但至少证明以病毒载体表达细胞因子在 IBD 基因治疗中是可行的. 与IL10一样, IL4也具有抑制巨噬细胞产生 TNF，IL1 等促炎细胞因子的作用. 此外, 作为 Th0 细胞向 Th2 细胞分化的主要诱导因子, IL4可调节 Th1/Th2 细胞平衡，缓解结肠炎症，但有研究11显示 IL4抗体能下调 SAMP1/Yit 鼠 IFN的表达并明显缓解肠道炎症, 而移植分泌 IL4的 Th 细胞可诱导 SCID 小鼠发生肠炎. 6因此 , IL4在肠道免疫中可能并非仅起抗炎作用, 其在人类 IBD中的确切作用尚有待确定. TGF作为一种抗炎细胞因子在肠道免疫平衡中发挥重要作用, Kitani 等12研究了 TGF1质粒在TNBS 诱导的结肠炎中的作用，结果显示鼻内一次给药可预防和治疗实验性结肠炎, 而腹腔给药无治疗作用 . 肠固有层和脾脏持续 2 wk 表达 TGF1 mRNA, 并同时出现产生 TGF1的 T 淋巴细胞和巨噬细胞, 且并不引起肠道、肺、脾、肝、肾发生纤维化. TGF除抗炎作用外, 在组织纤维化, 特别是病理性纤维化中也起重要作用. TGF1经蛋白激酶 C 和细胞外信号调节激酶 1/2 丝裂原活化蛋白激酶通路促进 CD 患者肠道成纤维细胞产生纤维连接蛋白、型胶原和结缔组织生长因子13. Vallance 等14 以表达 TGF1 的重组 AD5 载体灌肠, 导致小鼠结肠发生纤维化, TNBS 诱导的结肠炎恶化并加速肠壁纤维化进程. 4 展望 基因治疗为目前无法治愈的疾病提供了希望, 上述临床前试验为IBD 的基因治疗勾勒出了诱人的前景. 分子生物学的不断发展将使高效、特异性地下调基因表达成为可能. RNA 干扰是一种在生物体内普遍存在的、在 RNA 水平调节基因表达的方式, 双链 RNA 能高效、特异性地诱导与之同源的 mRNA 降解. 有报道称局部给予针对TNF的小干扰 RNA 能有效缓解胶原诱导的关节炎症 15. 综上所述, 虽然 IBD 的基因治疗研究已取得了令人鼓舞的成绩, 但仍应认识到基因治疗在 IBD 中尚处于起步阶段, 在应用于临床之前还7有很长的路要走. 【参考文献】 1 Man AL, PrietoGarcia ME, Nicoletti C, et al. Improving M cell mediated transport across mucosal barriels: Do certain bacteria hold the keys ?J. Immunology, 2004, 113(1):15-22 2 Ye X, Jerebtsova M, Ray PE. Liver bypass significantly increases the transduction efficiency of recombinant adenoviral vectors in the lung, intestine, and kidney J Hum Gene Ther, 2000, 11(4): 621-627. 3 Flotte TR. Gene therapy progress and prospects: Recombinant adenoassociated virus (rAAV) vectors J. Gene Ther, 2004, 11(10):805-810. 4 SchmiedlinRen P, Kesisoglou F, Mapili JA, et al. Increased transduction of human intestinal epith