1甲状腺肿瘤蛋白质组学研究进展【关键词】 甲状腺癌；肿瘤蛋白质组学；二维凝胶电泳；质谱摘要：蛋白质组学是在后基因组时代出现的一个新的研究领域，肿瘤蛋白质组学是其重要分支。本文从甲状腺肿瘤特异性分子标志物以及甲状腺癌治疗的分子靶点等几个方面，详细介绍了近几年来甲状腺肿瘤蛋白质组学的研究现状。关键词：甲状腺癌；肿瘤蛋白质组学；二维凝胶电泳；质谱Progress in research of thyroid oncoproteomicsShi Bingyin, Li hao(Department of Endocrinology, the First Affiliated Hospital, Medical School ofXian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Proteomics is a new research area of the postgenomic era. Oncoproteomics is an important branch of it. Here we discuss the investigative outcome of thyroid 2oncoproteomics in recent years, such as specific tumor biomarkers and antineoplastic drug.KEY WORDS: thyroid cancer; oncoproteomics; twodimensional electrophoresis; mass spectrometry甲状腺癌是内分泌肿瘤中最常见的一种，目前已从基因水平对其进行了广泛研究，但基因的功能最终需要通过相应的蛋白质发挥作用，而在 DNAmRNA蛋白质的转录及翻译过程中存在转录后剪切、翻译后修饰加工等多种方式，所以基因与蛋白质的表达之间存在着一定差异，有必要从蛋白质整体水平揭示肿瘤的发生发展，阐述其癌变本质。肿瘤蛋白质组学借助蛋白质组学研究技术，如二维凝胶电泳(twodimensional electrophoresis, 2DE)，电喷雾电离质谱(electrospray ionization mass spectrometry, ESIMS)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrixassisted laser desorption ionization timeofflight mass spectrometer, MALDITOFMS)等，可动态、整体、定量的考察甲状腺癌发生发展过程中蛋白质种类、数量的改变，比较肿瘤细胞与正常细胞蛋白质的表达差异，帮助研究者寻找用于肿瘤诊断及指导治疗的特异性分子标志物1。现将近几年来甲状腺肿瘤蛋白质组学的研究进展介绍如下。1 诊断甲状腺肿瘤的特异性分子标志物31.1 Galectin3 Galectin3(Gal3)是 半乳糖苷酶结合蛋白家族成员，分子质量为 31ku，主要存在于细胞质中，亦可位于胞膜及胞核。已有研究证明2，Gal3 可作为甲状腺恶性肿瘤特别是甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)的一个表型特征，考虑 Gal3 的表达和 PTC 细胞保持高度增殖活性有关，但其具体作用机制仍不明确。Paron 等3利用 2DE 和 MALDIMS 方法研究大鼠甲状腺细胞系 FRTL5 和 Kiras 癌基因转化细胞系 Kimol 的细胞核蛋白质表达差异，发现 Gal3 过度表达于 Kimol 中，而在 FRTL5 中不表达。研究表明 Gal3 通过和甲状腺转录因子 (thyroid transcription factor1, TTF1)的同源结构域相互作用使 TTF1 的转录活性上调，其 N 末端还可和细胞内的单链 DNA 及 RNA 结合。TTF1 是 NKx 型蛋白的一种，这些蛋白具有高度保守的同源结构域序列，故 NKx 同源盒基因家族其他成员也可和 Gal3 相互作用。TTF1 是甲状腺特有的甲状腺球蛋白和甲状腺过氧化物酶基因转录的调控因子，它的表达水平和甲状腺细胞增殖水平成正比。Gal3 通过和 TTF1 的相互作用调控甲状腺细胞的生长分化过程，在肿瘤的转化和转移方面起重要作用。1.2 DDIT3、ARG2、ITM1 和 C1orf 24 Cerutti 等4 在研究甲状腺滤泡癌和滤泡性腺瘤的蛋白质表达差异过程中，发现 4 种蛋白质的表达有统计学意义。它们分别为 DNA 损伤诱导转录因子43(DNA damageinducible transcript 3, DDIT3)、2 型精氨酸酶(arginase type , ARG2)、膜整合蛋白 1(integral membrane protein 1, ITM1)和 1 号染色体开放读码框架 24 又名 niban 蛋白(chromosome 1 open reading frame 24, C1orf 24)。进一步利用免疫组化方法研究发现，85.2%(23/27)的甲状腺滤泡癌 DDIT3和 ARG2 的表达均为阳性，而甲状腺滤泡型腺瘤 DDIT3 和 ARG2双阳性率仅为 9.4%(3/32)，联合检测 DDIT3 和 ARG2 诊断甲状腺滤泡癌，准确率可达 83%。DDIT3 在细胞应激及 DNA 损伤修复时表达，细胞内 RAS 和 PAX8PPARG 通路亦可激活其表达，推测DDIT3 和肿瘤细胞的恶性增殖及浸润性有关 5。ARG2 是精氨酸酶同工酶的一种，位于线粒体内，可将精氨酸水解为鸟氨酸及尿素，而鸟氨酸可以脱羧生成腐胺，然后转变为多胺。多胺是重要的生物学调控物质，在细胞分化、细胞周期的调节中起关键作用。精氨酸酶活性增加可导致细胞内鸟氨酸水平升高，进而促使癌症发生。ITM1 是一个高度保守的蛋白，推测它是一种新型通透酶。C1orf24分布于骨骼肌、胰腺及前列腺内，在甲状腺癌中的作用尚不明确。1.3 组织蛋白酶 B Srisomsap1 等6利用 2DE 对多种甲状腺疾病组织的蛋白质表达情况进行了研究,共分离出 32 个特异性蛋白质点，分子质量在 15-30ku 之间，等电点在 4.5-6.5 左右。这些蛋白质功能各有不同,包括参与构成细胞骨架的相关蛋白(肌动蛋白、原肌球蛋白、肌球蛋白)和蛋白构象改变有关的蛋白质热休克蛋白527，与转录及翻译有关的蛋白(核苷二磷酸激酶、延长因子 1)以及超氧化物岐化酶、组织蛋白酶 B(cathepsin B, CB)等。CB 是细胞溶酶体中的一种半胱氨酸蛋白酶，可降解层连蛋白、纤连蛋白、IV 型胶原等细胞外基质成分。研究表明, CB 在乳腺癌、甲状腺癌、肺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中表达上调，且活性明显升高7。肿瘤细胞CB 的表达上调及活性增强有助于降解基底膜主要成分 层粘蛋白和IV 型胶原，同时 CB 通过激活其他蛋白酶如胶原酶、尿激酶等产生协同作用使肿瘤易于侵袭及扩散。利用 ESIMS 分析 CB，结果显示有 4 个特异性的斑点： CB1、CB2、CB3 、CB4，其中 CB2、CB3在甲状腺滤泡型腺瘤、PTC 和甲状腺滤泡癌中的表达明显上调，而在结节性甲状腺肿和 Graves 病中表达减低。提示可以通过检测 CB水平鉴别那些在显微镜下难以区分的甲状腺滤泡型腺瘤和结节性甲状腺肿。1.4 MnSOD Russo 等8研究发现甲状腺乳头状癌细胞系TPC1 和甲状腺未分化癌细胞系 ARO 的细胞核蛋白质 2DE 电泳图谱大致相似，其中有一个蛋白质点较为特殊，在 TPC1 中的表达显著升高，而在 ARO 中检测不出。利用 MALDIMS 肽质谱指纹鉴定后证实该蛋白为锰超氧化物岐化酶(Mn superoxide dismutase, MnSOD)，免疫组化法表明 MnSOD 在正常甲状腺细胞的胞浆及胞核内均有表达，在 PTC 及甲状腺滤泡癌的胞核内表达水平明显降低，而在甲状腺未分化癌中几乎不表达，提示 MnSOD 可作为诊断甲状6腺未分化癌的分子标志物。MnSOD 在甲状腺细胞内的表达由 TSH通过不依赖 cAMP 的途径调控。它可以有效清除胞内氧自由基，影响细胞信号传导通路，并可在基因水平调节转录因子的活性。考虑MnSOD 在细胞核内表达水平的改变同细胞失去分化功能及具有侵袭性的改变是一致的，所以认为 MnSOD 可能是一种肿瘤抑制物，通过多种途径诱导细胞凋亡。1.5 Maspin Boltze 等9利用蛋白质组学方法研究原代培养的甲状腺细胞(primary cultured thyrocytes, PT)及 2.0Gy 粒子照射 PT 后的转化细胞(transformed thyrocytes, TT)的蛋白质表达差异。TT 在生长动力学方面显示出与 PT 巨大的差别，包括缺少接触抑制，分化较差等。利用 2DE 电泳技术分析 PT 和 TT 的蛋白质表达，分别分离出 122043 和 122855 个蛋白质点，其中 554 号蛋白质点较为特殊(分子质量 39606u，等电点 5.90)，其表达丰度在 TT 中显著升高，经 MALDIMS 肽质谱指纹鉴别后证实该蛋白为Maspin 蛋白。Maspin 是一种抑制肿瘤的丝氨酸蛋白酶抑制剂 10。研究表明 Maspin 和 p53 基因相互作用，在体外和体内抑制血管生成。免疫组化法证明 Maspin 蛋白可特异性的高表达于 PTC,表达率为 70%，而在正常甲状腺组织及其他几种甲状腺癌组织中几乎不表达。Ito 等11研究证明，Maspin 在分化较差的 PTC 细胞中的表达显著增多，而在分化较好的 PTC 细胞中的表达则相对减少。推测Maspin 在 PTC 的发生和转归方面起着重要作用,但其具体作用机制7仍有待进一步的研究12。2 治疗甲状腺肿瘤的分子靶点研究Paron 等13利用 2DE 和 MALDITOFMS 方法研究大鼠甲状腺细胞 p53 基因突变株的蛋白质表达差异，大约有 300 个特异性蛋白质点被分离出，其中 2 个热休克家族的蛋白质，热休克蛋白90(Hsp 90)和热休克蛋白 60(Hsp 60)表达上调，研究发现 Hsp 90表达上调和哺乳动物的细胞增殖功能及 p53 突变株的稳定性密切相关，故 Hsp 90 可在癌细胞中过度表达。目前一系列以 Hsp 90 为靶点的抗癌药物正在研制当中14，其中 Hsp 90 抑制剂格尔德霉素的衍生物 17 烯丙胺 17 脱甲氧格尔德霉素(17allylamino17demethoxygeldanamycin, 17AAG）在英国和美国已进入期临床试验。格尔德霉素可以特异性地作用于 Hsp 90的 ATP 结合位点，抑制其 ATPase 活性，还可以通过调节 Hsp 90的表达而发挥作用。Park 等15 研究发现格尔德霉素可以抑制甲状腺癌细胞的增殖，使突变的 p53 基因表达下调，并且抑制表皮生长因子介导的癌细胞浸润行为。Marsee 等16研究证明，格尔德霉素可以通过减少甲状腺细胞对碘的清除作用来提高其浓集碘的能力，提示格尔德霉素可以作为 131I 治疗甲状腺癌的辅助药物。BragaBasaria 等17将 17AAG 加入到各种甲状腺癌细胞系的培养基中后发现，在 0.1mmol/L 17AAG 的培养基中培养 72h 后，甲状腺乳头状癌细胞生长部分受抑，甲状腺滤泡癌细胞生长完全受抑，8甲状腺未分化癌细胞大量死亡，故甲状腺未分化癌细胞对 17AAG的细胞毒性作用最敏感，而乳头状癌细胞的敏感性最差，且癌细胞对 17AAG 的敏感程度和胞内 Hsp 90 水平成正相关。进一步研究发现 17AAG 只能促使甲状腺癌细胞死亡，而不能诱导其凋亡 ,推测甲状腺癌细胞抗凋亡的机制可能