1缺氧调控报告载体的构建与鉴定作者：杨洁，李占亭，杜德伟，柴青焕，王丽，张惠中，孙脊峰【关键词】 荧光素酶Construction and identification of hypoxia regulatory reporter vectors【Abstract】 AIM: To construct the firefly luciferase reporter gene vectors regulated by hypoxia response promoters. METHODS: The oligonucleotides of hypoxia response element (HRE) and a mutation control were synthesized and cloned into pCIneo vectors to constrct HRE/CMV recombinant vectors. Then HRE/CMV promoters amplified by PCR were subcloned into pGL3Basic vectors. RESULTS: The integrity reporter vectors were verified by restriction enzyme digestion. Also, the sequences of the vectors were detected and aligned to the expected sequences. CONCLUSION: Luciferase reporter vectors regulated by HRE/CMV promoters were successfully constructed, which makes it possible to further investigate their potency of 2hypoxia regulation.【Keywords】 transcription；regulation；hypoxia; response elements；luciferase；reporter gene【摘要】 目的：构建能用来检测缺氧应答启动子转录调控作用的萤火虫荧光素酶报告载体. 方法：合成缺氧应答元件 (HRE)的寡核苷酸序列及其突变对照，克隆入 pCIneo，构建 HRE/CMV 重组载体. 然后采用 PCR 方法将 HRE/CMV 启动子定向亚克隆入pGL3Basic. 结果：酶切和测序鉴定分析，所克隆的基因产物酶切结果与预期值一致，序列无碱基的突变. 结论：成功构建了缺氧应答启动子的荧光素酶报告载体，为进一步研究其缺氧调控作用提供了条件.【关键词】 转录；调控；缺氧; 反应元件；荧光素酶；报告基因0 引言目前已开发出多种报告载体用于研究启动子和/或增强子的调控活性1-3 ，如氯霉素乙酰转移酶报告载体， 半乳糖苷酶报告载体， 葡萄糖醛酸酶报告载体，碱性磷酸酶报告载体，绿色荧光3蛋白报告载体以及荧光素酶报告载体. 其中荧光素酶报告载体以其检测迅速、敏感和重现性好，被广泛应用于启动子和增强子转录调控的研究4. 在基因调控机制研究中，应用报告载体对可能调控哺乳动物基因表达的基因元件进行定量分析是极为重要和必要的. 缺氧应答元件(hypoxia response element, HRE)是对缺氧可做出应激反应的缺氧反应基因内一段小于 100 bp 的单拷贝或多拷贝的顺式作用元件，能够与转录因子缺氧诱导因子 1(hypoxia inducible factor 1, HIF1)结合，启动缺氧反应基因的转录，介导细胞对缺氧的反应5-6. 本文将各种不同缺氧应答基因的 HRE 与 CMV 启动子组合成缺氧应答启动子，构建其荧光素酶报告载体，快速对该遗传调控元件进行功能性分析.1 材料和方法1.1 材料 Taq DNA 聚合酶及 Kpn，Hind限制性内切酶购自 TaKaRa 公司. 质粒小量制备与纯化试剂盒、 PCR 试剂购自天为时代公司. Bgl，Sgf ，IPpo限制性内切酶和 pCIneo 真核表达载体、pGL3Basic 报告基因载体、JM109 菌种由 Promega 公司提供. HREs 的正向和反向单链由博雅公司合成（两端带有限制性内切酶的粘端切口）. 引物由奥科公司合成. 测序由基康公司完成. 其他试剂为进口或国产分析纯.41.2 方法1.2.1HRE 退火合成的 HRE 单链用去离子灭菌水稀释成 3 g/L，退火反应体系：正向单链 2 L，反向单链 2 L，1 退火液将总体积补至 50 L（退火液的配方：醋酸钾 0.98 g，HEPES 0.72 g，KOH 0.18 g，醋酸镁 0.043 g，去离子水 100 mL，溶解后高压蒸气消毒，备用）. 退火反应条件： 95 5 min 变性后，70 10 min，关掉水浴锅，缓慢降至 4，过夜.1.2.2HRE/CMV 重组载体构建带有 Bgl 和 Sgf 切口的HRE 正向和反向单链退火成双链后定向克隆入经相应酶切去除CMV 增强子的 pCIneo 载体，构建 HRE/CMV 重组载体，转化至JM109 大肠杆菌，挑选单克隆，提取重组质粒后对其行酶切鉴定，对符合预期值的克隆进行测序.1.2.3HRE/CMV 报告载体的构建以测序正确的 HRE/CMV 重组载体为模板，设计并合成含 Kpn，Hind限制性内切酶位点的引物，采用 PCR 方法克隆 HRE/CMV 调控序列. PCR 反应体系：2Taq PCR MasterMix，12.5 L；Primer1，1 L； Primer2，1 L；质粒模板， 1 L；总体积，25 L. PCR 反应条件：95 5 min 变性后， 95，30 s，68，45 s，72 ，45 s，30个循环. PCR 产物经电泳凝胶回收后，进行 Kpn 和 Hind双酶切，5定向克隆入经相应酶切的萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3Basic，转化至 JM109 大肠杆菌，挑选单克隆，提取重组质粒后对其行酶切鉴定，对符合预期值的克隆进行测序.2 结果2.1HRE/CMV 重组载体的鉴定合成的 HRE 正向和反向单链退火成双链后，与酶切后的 pCIneo 载体进行定向连接. 利用酶切对载体进行鉴定，选择 Bgl和 IPpo两个酶切位点，可得到约 280 bp 的片段. 酶切后电泳如图 1 所示，可见到与预期值相符的片段. 测序结果也与设计序列完全相同.M: DL2000 marker; 16: HRE/CMV(ENO，ENOm，VEGF ，EPO，hPGK ，mPGK) （Bgl+IPpo）.图 1pCIneoHRE/CMV 的酶切鉴定图（略）2.2HRE/CMV 报告基因载体的鉴定以 HRE/CMV 重组载体为模板进行 PCR，预期可获得约 150 bp 的 HRE/CMV 转录调控元件. 如图 2 所示，可见与预期大小相符的片段 . 将回收的特异片段经Kpn和 Hind双酶切后克隆入 pGL3Basic，转化后提取重组质粒酶切鉴定，如图 3 所示，可见与预期大小相符的片段. 测序结果完6全正确.3 讨论作为报告基因，荧光素酶是一类能催化底物并发射荧光的酶家族. 包括细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶以及近年发现的海洋腔肠荧光素酶. 其中萤火虫荧光素酶克隆于北美洲萤火虫基因，它编码一条 6.2104 的多肽链，其活性不需转录后修饰，无二硫键，不需要辅助因子和结合金属，几乎在任何宿主细胞中表达. 它能催化甲虫荧光素的氧化性羧化作用，发射出光子，可由光度计捕获并定量. 该酶半衰期很短，对于基因元件的诱导效应进行瞬间分析效果很好. 由于大多数生物缺少内源荧光，所以几乎无背景干扰. 鉴于此，萤火虫荧光素酶报告载体系统已广泛应用于不同启动子下外源基因表达强度和转录调控作用的研究. 报告基因分析系统一般需要 2 个不同的报告载体同时转染细胞，一个标化转染效率，作为内参照；另一个测定启动子调控活性. 萤火虫荧光素酶和海洋腔肠荧光素酶这 2 种报告载体具有兼容的化学特性、操作条件、速度、灵敏度、线性范围和仪器需要，使用标准光度计即可迅速完成测试.M：DL2000 marker; 16: HRE/CMV（ENO ，ENOm，VEGF ，EPO ，hPGK，mPGK ）.7图 2HRE/CMV PCR 产物（略）M: DL2000 marker; 16: HRE/CMV(ENO，ENOm，VEGF ，EPO，hPGK ，mPGK) （Kpn+Hind）.图 3pGL3BasicHRE/CMV 的酶切鉴定图（略）将 HRE 调控序列与 CMV 启动子组合后与报告基因连接，构建通过 HRE 调控报告基因表达的质粒 . 转染细胞后，通过细胞自身DNA 表达的转录因子，作用于基因调控序列. 如果转录因子对调控序列存在反式调控作用，此调控序列就会引发报告基因的表达. 由于报告基因的表达量是可检测并能进行定量分析，因而即可反映HRE 调控序列对基因诱导调控的作用 . 本研究设计组合了 5 个缺氧应答启动子及 1 个突变对照，并克隆于 pGL3Basic 萤火虫荧光素酶基因的上游，整合的 pGL3BasicHRE/CMV 载体经限制性酶切鉴定，载体测序结果也与预期完全相同. 这就为进一步研究 HRE/CMV 遗传调控元件的转录调控作用提供了资源和条件.【参考文献】1 Phippard D, Manning AM. Screening for 8inhibitors of transcription factors using luciferase reporter gene expression in transfected cells J. Methods Mol Biol, 2003, 225:19-23.2 Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression J . Science, 1994, 263: 802-805.3 Basu C, Kausch AP, Chandlee JM. Use of betaglucuronidase reporter gene for gene expression analysis in turfgrasses J . Biochem Biophys Res Commun, 2004, 320(1):7-10.4 Bronstein I, Martin CS, Fortin JJ, et al. Chemiluminescence: Sensitive detection technology for reporter gene assays J. Clin Chem, 1996, 42: 1542-1546.5 Caro J. Hypoxia regulation of gene transcription J. High Alt Med Biol, 2001, 2(2):145-154.6 Wenger RH, Stiehl DP, Camenisch G. Integration of oxygen signaling at the consensus HRE J . Sci STKE, 92005, 2005(306): re12.