1肝素对小鼠肝癌细胞 HcaF 和 HcaP 淋巴道转移的抑制作用作者：王宏梅，魏巍，谢涛，康晓慧，左云飞 ，张嘉宁【摘要 】 目的 观察肝素对小鼠肝癌高转移株 HcaF 和低转移株HcaP 细胞与冰冻淋巴结切片体外粘附和体内淋巴道转移的影响，探讨其作用的分子机制。方法 采用细胞黏附检测（StamperWoodruff Method） 、组织化学、流式细胞分析等方法，观察和检测肿瘤细胞粘附和转移的情况。结果 肝素体外对小鼠肝癌细胞 HcaF 和 HcaP 与冰冻淋巴结切片粘附有明显的抑制作用，100U、150U 肝素组与对照组比较有高度统计学意义（P 0.01） ；肝素体内对小鼠肝癌细胞 HcaF 淋巴道转移也有明显的抑制作用，100U 肝素组与对照组比较有统计学意义（P 0.05） 。结论 小鼠肝癌细胞 HcaF 和 HcaP 均有 L选择蛋白的表达，仅程度不同，L 选择蛋白的表达水平高低与 HcaF 和HcaP 细胞的淋巴道转移潜能正相关，肝素竞争性抑制 L选择蛋白与其配体的结合过程，从而达到抑制肿瘤细胞转移的目的，这可能是肝素抑制肿瘤及其转移作用的分子机制之一，由此也说明 L选择蛋白介导和协助了 HcaF 和 HcaP 细胞的淋巴道转移。 2【关键词】 肝素；L 选择蛋白；粘附；淋巴道转移HcaF 和 HcaP 是从小鼠腹水型肝癌细胞株 H22 中筛选出的特异性向淋巴道转移的细胞，HcaF 为高转移细胞株，淋巴结转移率高于 80，HcaP 为低转移细胞株，淋巴结转移率低于 30。研究表明1,2 ，不同淋巴结转移能力的 HcaF 和 HcaP 细胞中，HcaF 细胞的 L选择蛋白表达量明显高于 HcaP 细胞，L 选择蛋白可能介导和协助了 HcaF 和 HcaP 细胞经淋巴道的转移。实验表明3，肝素可以抑制 L、P 选择蛋白与 sLeX 的结合，这提示肝素可能是 L选择蛋白配体的竞争物。本实验采用 HcaF 和HcaP 细胞，以 615 小鼠为研究对象，观察不同浓度肝素对冰冻淋巴结切片体外粘附和体内淋巴道转移抑制作用的影响。1 材料与方法1.1 材料小鼠腹水型肝癌高低转移株细胞 HcaF 和 HcaP，由大连医科大学病理教研室克隆并冻存。615 小鼠，普通级，8 周龄，雄性，体重 2023g，由大连医科大学动物中心繁育提供，动物合格证号SCXK（辽）2002-0002 。肝素钠（150U/mg ，进口分装，上海生3物所） ；RPMI1640 完全培养液（ HyClone 公司） ；新生小牛血清（中美合资兰州民海生物工程有限公司） ；青链霉素（GIBCO/BRL公司） ；CFSE（Fluka 公司） 。CO2 恒温细胞培养箱（美国，HEPA公司） ；普通显微镜（日本，Olympus 公司） ；倒置显微镜（日本，Nikon 公司） ；THZC 恒温振荡器（江苏省太仓市实验设备厂） ；流式细胞仪（美国，BD 公司） ；石蜡切片机（德国） ；恒温冷冻切片机（英国） 。1.2 方法1.2.1 细胞培养 分别复苏 HcaF 和 HcaP 细胞，接种至正常615 小鼠腹腔，7 天后无菌条件下抽取腹水，再次接种于正常 615小鼠腹腔，5 天后无菌条件下抽取非血性腹水，以 PBS 缓冲液洗涤1 次，将细胞加入含 10灭活的小牛血清、RPMI1640 完全培养液中（含青霉素 100 U/ml，链霉素 100 g/ml） ，培养 24h 以使巨噬细胞贴壁，收集悬浮液，离心收集细胞。1.2.2 体外粘附抑制实验(StamperWoodruff Method) 配制终浓度为 50U、100U 、150U 不同肝素浓度细胞悬液（2105/ml ） ，不加肝素的细胞悬液做对照，37温育 10min。取正常 615 小鼠腹股沟、腋窝淋巴结做连续冰冻淋巴结切片（厚 7m） ，分别加入200l 不同肝素浓度的细胞悬液和对照液，37共温育 16h，取出4后倒去剩余液体，加入生理盐水，轻轻晃动洗涤 1 次，置于 7 冰箱 30min，然后用冷生理盐水震荡洗涤（ 40r/min，1min）3 次，洗去未黏附细胞。95冷乙醇固定 5min，HE 染色（苏木素 伊红染色，hematoxylineosin staining） ，观察细胞粘附部位及数量，随机计数 5 个低倍视野（ 100）并照相保存。实验重复六次。1.2.3 体内淋巴道转移抑制试验 本实验分对照、100U 肝素 2 组，每组 10 只小鼠。分别制备 HcaF 和 HcaP 细胞悬液（6107/ml） ，配制成 100U 肝素浓度细胞悬液，生理盐水细胞悬液做对照，37温育 10 min。取 50 l（3106 个细胞）细胞悬液正常 615 小鼠足垫注射， 以后每隔 3 天 100U 肝素组足垫再注射50 l 100U 肝素溶液 , 对照组再注射生理盐水 50 l。4 周后颈椎脱位法处死小鼠，取同侧腘窝、腹股沟、腋窝淋巴结，称其重量，然后 4中性甲醛固定，石蜡切片， HE 染色，镜下观测转移发生情况，只要一个部位淋巴结可见肿瘤细胞浸润便确定为发生转移。1.2.4 淋巴结归巢实验 本实验 HcaF 和 HcaP 细胞各分对照、100U 肝素 2 组，每组 5 只 615 小鼠。配制 100U 肝素浓度细胞悬液（2107/ml） ，生理盐水细胞悬液做对照，37 温育 10 min。然后加入 CFSE4（羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺脂，终浓度为5 M） ，37 温育 20 min。正常 615 小鼠足垫注射 50 l（1106个细胞） ，1 h、12 h 后颈椎脱位法处死小鼠，取同侧腘窝、腹股沟、5腋下淋巴结，在 0.5ml 生理盐水中，剪碎淋巴结，装入 Ep 管中，加入 0.1胶原酶 1 l 降解 30 min，避光保存，尼龙膜筛网过滤，流式细胞仪检测 HcaF 和 HcaP 细胞经淋巴道转移到淋巴结的细胞百分率，并显微计数分析。按下列公式计算出转移到淋巴结的肿瘤细胞个数。转移肿瘤细胞数=细胞数/ml1/2 肿瘤细胞转移百分率1.3 统计学分析数据分析采用 SPSS10.0 统计软件进行检验分析, 组间比较采用单因素方差分析法（OneWay ANOVA） 。2 结果2.1 体外粘附抑制实验结果在 HcaF 和 HcaP 细胞与冰冻淋巴结切片共温育 16 h 的对照组中，粘附结合的细胞数 HcaF 明显多于 HcaP，且粘附部位多发生在被膜下窦，也有些粘附于小梁区和皮质浅层，见图 1。加入不同浓度肝素处理后，其粘附细胞数量均下降，呈剂量效应关系，与对照组相比，100U、150U 肝素组抑制效果尤为显著，粘附数量6少，被膜下窦部位几乎无黏附，P0.01，差异有高度统计学意义，见图 2。2.2 体内淋巴道转移抑制实验结果2.2.1 小鼠淋巴结重量比较 HcaF 细胞 100U 肝素组与对照组各部位淋巴结重量相比，明显低于对照组，见表 1（P0.05） ，差异有统计学意义；而 HcaP 细胞 100U 肝素组与对照组各部位淋巴结重量相比，低于对照组，见表 2，但 P0.05，差异无统计学意义。表 1 HcaF 细胞 100U 肝素组与对照组淋巴结重量的比较2.2.2 小鼠淋巴结组织切片观察 淋巴结切片 HE 染色，显微镜下观察各淋巴结肿瘤细胞浸润情况，可见肿瘤细胞浸润的淋巴结多发生在腹股沟，淋巴结的正常结构被破坏，肿瘤细胞大多成团、成片浸润在被膜下窦，其次是髓窦，严重的淋巴结几乎被肿瘤细胞所取代。未发生肿瘤细胞转移的淋巴结常可见炎性细胞的大量浸润。HcaF 对照组肿瘤细胞淋巴结转移率为 88.9，100U 肝素组淋巴结转移率为 44.4；HcaP 对照组肿瘤细胞淋巴结转移率为22.2，100U 肝素组淋巴结转移率为 12.5，见图 3。 2 检验，100U 肝素对 HcaF 细胞向淋巴结转移有良好的抑制作用，与对照组比较, P=0.046，差异有统计学意义（P0.05） ；而 100U 肝素对HcaP 细胞向淋巴结转移同样有抑制作用，与对照组比较，7P=0.6，差异无统计学意义。2.3 淋巴结归巢实验结果CFSE 荧光染色后，流式细胞仪检测 1 h、12 h 转移到淋巴结的HcaF 和 HcaP 细胞的百分率，并显微镜下计数。100U 肝素组与对照组相比，转移到淋巴结的肿瘤细胞数减少，P0.05,差异有统计学意义，见图 4。可见肝素对 HcaF 和 HcaP 细胞向淋巴结转移有明显的抑制作用。3 讨论3.1 L选择蛋白在肿瘤淋巴道转移中的作用L选择蛋白为型跨膜糖蛋白，由 324 个氨基酸残基构成，其基因定位于 1 号染色体长臂上。 L选择蛋白组成性地表达于大多数白细胞表面，其正常生理功能是作为淋巴细胞到达外周淋巴结的“归巢”受体。Irjala 等5 提出 L选择蛋白介导淋巴细胞进入和游出淋巴结是通过与淋巴系统不同部位的不同配体相结合，从而实现淋巴细胞的“归巢”和再循环。有研究认为肿瘤细胞的淋巴道转移与淋巴细胞的“归巢”现象有相似之处 6，7 。HcaF 和 HcaP 是分别具有高、低淋巴道转8移潜能的小鼠肝癌细胞株，刘敏等1，2研究结果表明，在 HcaF和 HcaP 细胞表面均有 L选择蛋白的表达，且 HcaF 细胞的表达量明显高于 HcaP 细胞；体外粘附实验结果表明 HcaF 细胞与615 小鼠冰冻淋巴结切片的粘附力较强，而 HcaP 细胞的粘附力较弱，与 L选择蛋白的表达程度相一致。用抗 L选择蛋白的抗体阻断后，HcaF 细胞与冰冻的 615 小鼠淋巴结切片之间的黏附程度显著降低，并呈剂量依赖关系。因此推测 L选择蛋白可能介导和协助HcaF 和 HcaP 细胞经淋巴道的转移，其作用机制和过程类似淋巴细胞的归巢，以受体 配体对的形式参与肿瘤细胞的淋巴道转移。3.2 肝素抑制肿瘤转移的机制肝素是一类结构异常复杂的糖胺聚糖，主要是由糖醛酸和葡萄糖胺以 14 糖苷键连接起来的重复二糖单位组成的多糖链的复合物。因其所含重复单位的不同，分子量变化很大，大约在 4 00020 000 之间，而二糖单位上的 N硫酸化、O 硫酸化和 N乙酰化等多种方式的取代使肝素产生了巨大而复杂的结构。与肝素复杂结构相对应的是肝素具有多种生物学功能，除具有公认的抗凝血及其相关的抗血栓生成活性以外，近年来发现肝素还具有抑制平滑肌细胞增殖、抗炎症、抗肿瘤、抗病毒以及增强机体免疫等功能，并且这些生物学活性同其抗凝血活性无关，而是与肝素的特异结构密切相9关8。一般来说，糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖上唾液酸化、岩藻糖基化或硫酸化的聚糖是 L选择蛋白的天然配体。四糖结构 sLeX（sialyl Lewis X）和 sLeA（sialyl Lewis A）是已知的 L选择蛋白所能识别的最小配体单位。实验表明，肝素可以抑制 L、P 选择蛋白与sLeX 的结合，这提示肝素是 L选择蛋白配体的竞争物 ,阻断 L选择蛋白与其配体的结合过程，可能抑制 L选择蛋白阳性的肿瘤细胞经淋巴道的转移。体外粘附实验结果表明，在用不同浓度肝素处理之后，HcaF和 HcaP 细胞与 615 小鼠的冰冻淋巴结切片之间的粘附程度降低，并呈剂量效应关系。体内淋巴道转移和淋巴结归巢实验结果也说明，肝素对 HcaF 和 HcaP 细胞的淋巴道转移有明显的抑制作用。小鼠肝癌细胞 HcaF 和 HcaP 均表达 L选择蛋白，但表达量不同，肝素竞争性抑制或阻断 L选择蛋白同其配体的结合过程，降低了肿瘤细胞的粘附，从而达到抑制肿瘤细胞淋巴道转移的目的，这可能是肝素抑制肿瘤及